臭氧水冷殺菌工藝對年糕中椰毒假單胞菌和擴展青霉菌的抑制作用研究

陳山喬

（寧波市農業科學研究院，浙江寧波 315040）

臭氧是一種不穩定的氧化劑，在短時間內會降解為氧氣，其溶于水形成的臭氧水具有潛在的殺菌作用[1]。臭氧殺菌過程屬于生物化學氧化反應[1-2]，主要機理是其氧化性導致微生物的膜結構等的完整性降低，造成細胞的通透性改變，或干擾其物質能量代謝，從而抑制其增殖[2]。擴展青霉菌（Penicilliumexpansum，PE）在自然界中廣泛分布，是多種食品腐爛發霉的重要原因之一，且具有潛在的致癌毒性風險，因此在研究中需要特別關注[3]。椰毒假單胞菌（Pseudomonas cocovenenans，PC）為革蘭氏陰性短桿菌，有食用含有由椰毒假單胞菌屬酵米面亞種產生的“米酵菌酸”的“酸湯子”而發生慘劇的案例[4]。因此其在研究中也需要特別的關注。

以年糕為代表的米制品由于其天然缺乏抑菌活性物質，微生物易于攝取利用，因此在生產后的貯藏和流通過程中，極易由于微生物的增殖而腐敗，造成嚴重的食品安全問題。因此，目前行業內普遍在年糕包裝后進行水熱殺菌，但其會使年糕質構和口感發生變化，使得產品發硬，彈性降低。針對這一問題，本研究引入臭氧冷殺菌工藝，以PC、PE為研究對象，驗證了臭氧對PC與PE的殺滅作用，并使用年糕樣本作為材料進行了滅菌效果驗證，得出了濃度、溫度對臭氧在年糕中殺菌效果的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

可控恒溫式反應器（水套式自動溫控，帶有T形攪拌，容積30 L），賽默飛世爾科技（中國）有限公司；臭氧發生器（氧氣源電暈式），深圳市飛立電器科技有限公司；臭氧濃度測定儀，邦億精密量儀（上海）有限公司；PE菌株、PC菌株，中國普通微生物菌種保藏管理中心；培養基、培養皿，上海生工生物有限公司；麥氏比濁管，廣東環凱生物科技有限公司；無菌水、臭氧，實驗室現場制備。

1.2 試驗方法

1.2.1 臭氧水體外殺菌試驗

分別使用營養肉湯培養基和改良馬丁培養基搖瓶液體培養PC和PE至平臺期。在恒溫反應器中加20 L滅菌水并開啟攪拌。待其達到設定的溫度（15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃及35 ℃）后，通入臭氧并用臭氧檢測儀實時測定水中臭氧濃度，達到設置濃度（0.50 mg·L-1、1.00 mg·L-1、2.00 mg·L-1、4.00 mg·L-1、8.00 mg·L-1、10.00 mg·L-1、20.00 mg·L-1）后，加入通過麥式比濁法測定并稀釋的前述培養菌液，使最終水中的菌體濃度為1×105CUF·mL-1，開始計時的同時關閉臭氧發生器。處理前5 min以10 s為間隔對反應器中的水進行5 mL每次的周期性采樣，5～15 min以30 s為 間 隔，15～30 min以1 min為 間 隔，30～60 min以2 min為間隔。采集結束后記錄反應器中殘余的臭氧濃度。采集水樣，分別對被試菌進行菌落計數，以菌落總數為未檢出（ND）所對應的時間為最小殺滅接觸時間，計算其殺菌半衰期，用以衡量殺菌速度。

1.2.2 菌落總數檢測

采用平板記數法，PC使用平板菌落計數培養基，PE使用孟加拉紅培養基。

1.2.3 臭氧水在年糕殺菌中的驗證

年糕成型后，通過表面涂抹前述由麥式比濁法定量稀釋后的菌液，接種被試微生物，之后置于3種濃度臭氧水中冷卻浸泡10 min（12.5 mg·L-1、10.0 mg·L-1、7.5 mg·L-1），晾干后進行真空包裝。之后在室溫下貯藏，每3 d進行一次采樣，檢測其菌落總數。

2 結果與分析

2.1 臭氧水的滅菌效果

2.1.1 臭氧水對被試微生物的殺滅作用

為了考察臭氧水對PC和擴展青霉菌的殺滅作用，本文以臭氧濃度為變量，在25 ℃下，由低到高設置了8個試驗組，以完全殺滅被試微生物的最小接觸時間作為表現殺菌能力的特征指標進行了試驗，試驗結果如表1所示。

由表1可知，臭氧濃度越高，其最小殺滅接觸時間越短，半衰期也越短。對于PC，在20.0 mg·L-1的臭氧質量濃度下，達到未檢出的接觸時間僅為2.67 min，在臭氧質量濃度為0.50 mg·L-1時，為了獲得同樣的消毒效果，接觸時間則應該不少于44 min。對于PE，同樣濃度的臭氧水，其殺滅速度較PC更慢，在20.0 mg·L-1的臭氧質量濃度下，達到未檢出的接觸時間為3.17 min，在臭氧濃度為0.50 mg·L-1時，必需的接觸時間則高達54.00 min。對于這兩種不同的被試微生物，其臭氧水殺菌效率的不同，可能是由于其細胞結構存在差異。例如，真菌細胞有著更完善的抗氧化系統[5]，以及抗逆性更強的細胞壁[6]。

2.1.2 不同溫度臭氧水對微生物殺滅作用的影響

在不同溫度下，10.0 mg·L-1的臭氧水，其最小殺滅接觸時間和滅菌終止時水中的臭氧殘留如表2所示。隨著溫度的上升，兩種被試菌株的最小殺滅接觸時間有略微上升，即其殺菌性能有所下降。結合終止時臭氧殘留量可知，出現這一現象的原因可能在于隨著溫度的升高，臭氧在水中的降解、析出速度加快。考慮到殺滅接觸時間的變化幅度較小，因此在實際工藝中無需對溫度進行額外的控制。

表2 不同溫度下臭氧的質量濃度

2.2 臭氧水在年糕殺菌中的驗證

如表3所示，7.5 mg·L-1的臭氧水處理未能完全將年糕殺菌至無檢出，而10.0 mg·L-1的臭氧水處理能夠維持無檢出3 d，12.5 mg·L-1的臭氧水處理則可以維持6 d。根據《年糕》（SB/T 10507—2008）[7]和《食品安全國家標準 速凍面米與調制食品》（GB 19295—2021）[8]的要求，7.5 mg·L-1、10.0 mg·L-1、12.5 mg·L-1的臭氧水處理分別維持年糕中被試微生物菌落總數合格的天數為0 d、6 d、12 d（以上）。從實際接種后年糕的殺菌結果來看，臭氧的實際滅菌效果低于純粹的水環境，這可能是一部分菌體埋入了年糕中，減少了實際與其作用的臭氧含量所致。

表3 貯藏年糕的菌落總數

3 結論

臭氧能夠有效殺滅年糕中的主要致腐菌。體外滅菌試驗表明PC和PE與臭氧水的最小殺滅接觸時間隨臭氧濃度的增加而減小，殺菌半衰期也隨濃度的增加而減小。殺菌過程中的溫度升高會輕微的減小臭氧水的滅菌效果，但是其變化幅度較小，實際生產工藝開發中無需進行控制。對接種被試菌的年糕進行殺菌的試驗表明，10.0 mg·L-1以上的臭氧濃度才能夠徹底殺滅年糕中的致腐菌，且12.5 mg·L-1的濃度才可以將其菌落總數維持在合格水平12 d以上。