雙相障礙患者HPA軸改變與血清蛋白表達譜差異研究*

程宇航 謝靜 何山 田玉潔 馬征 李文標

·論著·

雙相障礙患者HPA軸改變與血清蛋白表達譜差異研究*

程宇航1謝靜2何山1田玉潔1馬征1李文標1

目的 探討雙相情感障礙（BD）患者丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA）功能改變的血清蛋白質表達的差異。方法選取57例BD患者，根據有無HPA軸改變分為異常雙相障礙組（異常組，22例）和正常雙相障礙組（正常組，35例），采用弱陽離子交換（WCX）納米磁珠捕獲血清蛋白質組分，用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）檢測蛋白質質譜。結果異常組患者血清差異蛋白分子降低，在異常組與正常組之間篩選20個差異表達蛋白分子（P＜0.05），8個差異蛋白峰為異常組患者特有表達。以質荷比為M4166.52、M6643.63、M6861、M10847.9的分子建立了診斷模型，其敏感性和特異性分別為86.4%和94.3%。結論雙相障礙患者HPA軸功能異常，導致血清差異蛋白表達異常，可能有其特征性病理機制。

雙相情感障礙 HPA 生物標志物 蛋白質組學 磁珠 基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜

雙相障礙（Bipolar Disorder，BD）是一種慢性復發性精神疾病，已具有某些躁狂和抑郁發作期為特征。是情感性精神障礙的一個亞型。該疾病預后不良，復發率、自殺率和自殘率均很高，是一種嚴重的精神疾病。雙相障礙病因尚未明確，可能與遺傳因素、生物學因素和心理社會因素關系密切。多數研究顯示雙相障礙和神經內分泌功能失調有關，包括下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA）和下丘腦-垂體-甲狀腺軸（HPT），其中，HPA軸功能失調是主要標志，包括中樞促腎上腺皮質激素釋放激素（CRH）分泌增多，精氨酸加壓素的分泌異常，外周血皮質醇（CORT）和促腎上腺皮質激素（ACTH）的含量升高等［1，2］。HPA軸功能亢進可能導致HPT軸功能缺失［3］，情感障礙神經內分泌紊亂的確切機制目前還不是很清楚，受到檢測技術手段的限制，臨床上尚缺乏可靠的生物學診斷指標支持。基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（Matrix Assisted Laser Desorption IonizationTime of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF-MS）是一種重要的蛋白質組學技術，在許多疾病的蛋白質組學研究上發揮著非常重要的作用，已用于多種疾病的生物標志物探索及早期診斷［4～6］。前期，我們采用WCX納米磁珠結合蛋白芯片閱讀儀聯用的蛋白指紋圖譜技術，對雙相障礙患者血清蛋白質組學進行初步研究，獲得了與其他精神疾病有顯著差異的蛋白質譜［7］，為情感障礙亞型特異性提供了生物學依據。進一步對HPA軸異常與正常的雙相障礙患者血清差異蛋白進行分析，尋找有意義的差異蛋白譜峰，建立HPA軸異常的情感障礙患者血清蛋白診斷模型，為篩選情感障礙患者血清生物標志物提供一種新的途徑。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2012年～2013年在北京安定醫院住院的雙相情感障礙患者。共57例，其中男27例，女30例；年齡18～50歲；病程3個月～12年，中位數為2.2年。依據國際疾病分類第十版（ICD-10）診斷標準，確診入組雙相情感障礙患者。近期內未使用激素及免疫調節劑，入組前1個月未服用抗精神病藥物。患者無酒精依賴史、中樞神經系統器質性病變及心肝腎功能不全等重大軀體疾病史。分組標準：異常雙相情感障礙組（異常組）22例（其中男10例，女12例），促腎上腺皮質激素（ACTH）及皮質酮（CORT）檢測值有1項及以上異常者；正常雙相情感障礙組（正常組）35例（其中男17例，女18例），ACTH及CORT檢測值均在正常參考范圍；ACTH參考范圍0～37 pg／m l、CORT參考范圍5～25μg／dl（AM）［8］。

1.2 實驗方法

1.2.1 標本采集 （1）血清標本采集：于上午6～8點空腹采集患者全血5m l，置于真空負壓管中，不加抗凝劑，室溫靜置1 h，2 000 g離心20 min，取上清液。分裝在500μl的EP管中，－80℃冰箱保存。所有血清樣本直至進行MALDI-TOF-MS前進行解凍。（2）血漿標本采集：于上午6～8點空腹采集患者全血3 m l，置于EDTA-3K抗凝管中，離心1 500 g／min，5 min，取血漿，置－80℃冰箱保存批量檢測。

1.2.2 實驗測定

1.2.2.1 ACTH及CORT測定 采用化學發光法進行檢測，ACTH應用順序免疫度量實驗，CORT采用競爭法，由天津德普生物技術和醫學產品有限公司提供檢測試劑盒，測定儀器為IMMULITE 1000全自動化學發光免疫分析儀（美國DPC公司）。測定ACTH、CORT的批內變異系數均＜10%。

1.2.2.2 血清蛋白質譜分析 （1）制備樣本：從－80℃冰箱取出血清，置于冰上融解。10 000 rpm離心20 min。取上清10μl與20μl的U9緩沖液（9 mol／L Urea，20 g／L CHAPS，10 g／L DTT，50 mmol Tris-HCl，pH9.0）混合。4℃振蕩孵育30 min后，加入100 mmol／L醋酸鈉緩沖液（pH4.5）370μl。（2）WCX納米磁珠的活化：取WCX納米磁珠混懸液50μl，用100μl醋酸鈉緩沖液洗滌磁珠2次，5 min／次。（3）采用WCX納米磁珠捕獲血清蛋白：將100μl處理好的血清樣品加入活化的磁珠中，振蕩孵育1 h。放置在磁性分離板上2 min，棄上清液。加入100μl醋酸鈉緩沖液洗滌2次，5 min／次。用10μl0.5%（v／v）的TFA洗脫磁珠5 min。取5μl洗脫液與等量的SPA溶液充分混合，吸取2μl混合物進行點樣，室溫下自然干燥，用PBSⅡ-c型MALDI-TOF-MS質譜儀（購自美國BioRad公司）檢測血清蛋白組分，并繪制蛋白質指紋圖譜。（4）芯片質控和重復性：每個芯片在實驗過程中均隨機加入1個血清質控樣品（質控品由北京德易臨床檢驗醫學中心提供），蛋白質峰平均CV＜15%。

1.3 統計學處理 采用BioMarker Wizard 3.1軟件及SPSS16.0軟件對芯片檢測得到的蛋白指紋圖譜數據進行統計學處理。異常組與正常組之間的差異蛋白峰比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。以上述數據為基礎，采用Biomarker Patterns S of tware 5.0（BPS）分析HPA軸異常情感障礙的生物標志物，并建立分類樹模型。

2 結果

2.1 兩組蛋白指紋圖譜比較 檢測57例BD樣本，得到114個蛋白峰，有20個蛋白峰有顯著性差異（P＜0.05）。見表1。

表1 篩選出的20個P＜0.05的差異蛋白分子（±s）

表1 篩選出的20個P＜0.05的差異蛋白分子（±s）

注：*為僅在異常組中檢出的差異蛋白質點

M／Z異常組（n＝22）正常組（n＝35）t值P值M1147.07*4.23±2.82 2.62±1.64 2.159 0.042 M3326.41 2.26±2.41 4.04±3.01－2.080 0.043 M3827.15*4.50±2.92 3.08±1.81 2.049 0.046 M3899.39 5.08±4.66 8.32±4.94－2.199 0.033 M4166.52*0.97±1.10 2.96±3.45－2.915 0.006 M4486.08 6.01±4.93 16.30±10.44－4.571 0.000 M4804.58 4.90±3.85 7.77±4.64－2.274 0.029 M5929.00 20.15±11.73 31.16±17.28－2.590 0.013 M6445.62 9.52±11.38 21.20±15.27－2.747 0.009 M6643.63 20.93±18.88 38.41±16.68－3.291 0.002 M6861.00*1.95±1.81 5.06±3.82－3.777 0.000 M7793.51 12.02±9.40 24.13±18.65－2.955 0.005 M7942.19 3.26±3.03 8.17±7.24－3.249 0.002 M8355.33 0.77±0.82 1.42±1.18－2.215 0.032 M8716.21*21.78±18.05 32.51±17.14－2.022 0.049 M8941.33*2.67±3.35 6.43±4.91－3.103 0.003 M8967.17*1.20±1.10 2.82±2.50－3.103 0.003 M10847.9 0.53±0.49 1.19±0.59－3.923 0.000 M11708.0*1.50±1.05 2.23±1.18－2.129 0.039 M24041.8 2.80±2.07 4.43±2.79－2.098 0.042

圖1 異常組與正常組患者的部分蛋白的典型圖譜

圖2 區分BD患者HPA軸異常的決策樹

2.2 BD患者HPA軸異常血清蛋白標志物的篩選及診斷模型的建立 從20個差異蛋白分子中篩選出方差齊且P＜0.01的10個差異蛋白分子導入BioMarker Patterns S of tware Version 5.0（BPS）分析軟件，篩選出M／Z為M4166.52、M6643.63、M6861、M10847.9蛋白峰為診斷HPA軸異常雙相障礙的最佳標志物（圖1）。以這4個差異蛋白建立了分類樹模型（圖2），敏感性86.4%，特異性94.3%，當滿足蛋白峰強度M10847.9≤0.708291且M4166.52≤1.29514進入終節點1或M10847.9＞0.708291且M6861.00≤4.31954且M6643.63＞49.529進入終節點4時，則模型判斷為HPA軸異常的BD。以敏感性為縱座標，1-特異性為橫坐標，繪制ROC曲線圖，曲線下的面積（AUC）為0.948，見圖3。

圖3 HPA軸異常BD診斷模型的ROC曲線

3 討論

下丘腦-垂體-腎上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）軸是神經內分泌免疫調節的重要軸路之一，其功能的變化直接影響著機體的健康狀況，由各類應激因素引起的HPA軸功能紊亂，主要表現為HPA軸功能的亢進。近年研究表明，HPA軸亢進是導致糖尿病和抑郁癥等多種疾病的主要發病機制之一［9，10］。臨床研究發現，HPA軸異常的情感障礙患者病情有可能更重，HPA系統功能恢復與患者的療效及預后密切相關［11，12］。關于HPA軸功能亢進的血清蛋白質組學特征，目前沒有研究報告。本研究中，我們采用MALDITOF-MS和WCX納米磁珠聯用的蛋白質指紋圖譜技術檢測了57例雙相情感障礙患者的血清低分子量蛋白指紋圖譜。各樣品的質譜范圍均顯示在2～20 kD之間。表明WCX磁珠對pH為4.5狀態下血清中帶正電荷的低分子量蛋白具有較好的捕獲能力。對可檢測到的114個蛋白峰的統計分析顯示，異常組較正常組的患者間有20個蛋白峰存在顯著性差異（P＜0.05），其中有10個差異蛋白表達下降（P＜0.01），而且異常組患者有特征性差異蛋白峰，它們是M1147.06、M3827.15、M4166.52、M6861.00、M8716.21、M8941.33、M8967.17、M11708.00。這些差異蛋白質點也沒有在我們已經報道的正常人和其他精神疾病中發現［7］。表明這部分患者有不同于其他類型精神疾病的生物學特征，進一步追蹤這些差異蛋白質點的變化可能有助于了解雙相情感障礙的病理過程。Stelzhammer V等［13］研究了雙相障礙與重癥抑郁癥死后腦垂體蛋白質組學，發現BD患者有大量阿片黑素促皮質激素原（POMC）和甘丙肽表達。POMC是垂體多種激素的前體，垂體前葉促腎上腺皮質激素細胞將POMC處理成ACTH和β-促脂素。推斷垂體POMC的大量表達導致ACTH和CORT分泌增加，可能是雙相障礙患者HPA軸功能紊亂的病理機制。研究發現外周血ACTH和CORT表達增高的雙相障礙患者，表現出特征性的血清蛋白差異表達譜，推測HPA軸功能紊亂，導致蛋白質代謝發生障礙，實驗結果支持下丘腦-垂體-腎上腺軸參與了雙相情感障礙發病機制，其蛋白表達之間的相互作用應該是有前途的研究方向之一。

本研究發現雙相情感障礙患者HPA軸異常血清差異表達蛋白質點，但因這些蛋白屬低豐度蛋白，現有方法學分離和鑒定十分困難［14］，故沒有進行鑒定。然而，正是這些低豐度蛋白帶給研究者十分重要的信息，研究者嘗試以4個差異蛋白分子構成的診斷模型（圖2），其敏感性為86.4%，特異性為94.3%，ROC曲線顯示AUC在0.9以上具有較高的準確性，說明診斷效果較好。其臨床應用價值有待于大樣本量的盲法驗證、評估與修正。

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A study of the differences between serum protein expression profile and hypothalamus-pituitary-adrenal（HPA）axis in patients with bipolar disorder．

CHENG Yuhang，XIE Jing，HE Shan，et al．
Beijing Anding Hospital，Capital Medical University，Beijing 100088，China

Objective To explore the differences between serum protein expression pr of ile and hypothalamus-pituitary-adrenal（HPA）axis in patients with bipolar disorder（BD）.MethodAtotal of 57 patientswith BD were divided into exception group（22 cases）and normal group（35 cases）according to exception or normal function of HPA in the patients.The serum of two groupswas tested with weak cationic exchange（WCX）magnetic beads for constituents of serum protein and Martrix-Assisted Laser Desorption／lionization Time of Flight Mass Spectrometry（MALDI-TOF-MS）for the proteomics.ResultsThere were differences for 20 protein biomarker peaks between exception group and normal group（P＜0.05）and specific expressions for 8 protein biomarker peakswere found in exception group.The diagnosticmodelwas established based on thesemoleculeswith the mass-to-charge ratio of M4166.52，M6643.63，M6861 and M10847.9；it was 86.4%for the sensitivity and 94.3%for the specificity.ConclusionThere are some correlations between the dysfunction of HPA and the dysfunction of serum protein expression in patientswith BD and theremay be characteristic pathologicalmechanism between them.

Bipolar disorder Hypothalamus-pituitary-adrenal Biomarkers Proteomics Magnetic beads Martrix-assisted laser desorption／lionization time of flightmass spectrometry（MALDI-TOF-MS）

R749.4

A

2095－9346（2015）－06－0401－05

10.3969／j.issn.2095－9346.2015.06.001

2015－08－16）

首都衛生發展專項基金（編號：首發2011-2012-04）

1.100088 北京市，首都醫科大學附屬北京安定醫院 2.中國協和醫科大學北京協和醫院