蜂王漿中四環素類藥物殘留量的測定方法研究

葉有標 祝子銅 章應俊 劉國群

摘 要：采用液相色譜-質譜聯用技術，建立測定不同狀態的蜂王漿中4種四環素族抗生素殘留量的測定方法。蜂王漿樣品試樣中四環素族藥物殘留量用0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液提取，經過濾和離心后，上清液用PLS固相萃取柱凈化，液相色譜串聯質譜儀測定，外標峰面積法定量。4種藥物基本實現分離以及定性定量。蜂王漿中四環素藥物殘留的測定低限（LOQ）為10 μg/kg，線性范圍為10～50ng/mL。回收率均在88.0%～102.0%之間，相對標準偏差（RSD）不大于20%。土霉素、四環素，金霉素、強力霉素的檢測限為10μg/kg。該方法靈敏、可靠，可用于不同狀態蜂王漿中4種四環素類抗生素的同時檢測。

關鍵詞：液相色譜-質譜聯用技術 蜂王漿 四環素類抗生素

中圖分類號：R9781 文獻標識碼：A 文章編號：1674-098X（2015）03（c）-0018-01

該文采用高效液相色譜法和高效液相串聯質譜法對不同狀態的蜂王漿的檢測分析技術研究，期建立一種能符合對不同狀態的蜂王漿的檢測的技術，確保測試結果準確性。為蜂產品檢測四環素類抗生素提供技術支持。通過系列實驗結果表明，該方法能滿足蜂王漿產品檢測需求。

1 實驗部分

1.1 安全提示

本方法在樣品處理時，應戴上防護手套避免甲醇、甲酸對身體的傷害。若濺到皮膚和眼睛，應立即用大量清水沖洗，情況嚴重者應盡快到醫院治療。

1.2 儀器和設備

Agilent 1200高效液相色譜-串聯質譜聯用儀，配有電噴霧（ESI）離子源、渦旋振蕩器、離心機：轉速≥4000 r/min、聚丙烯具塞塑料離心管：50 mL、

分析天平：感量0.0001 g、移液槍：50 μL、200 μL、1000 μL、一次性滴管、固相萃取裝置、玻璃離心管：10 mL、氮吹儀、微孔濾膜，0.45 μm、0.2 μm、PH計。

1.3 試劑與材料

有機溶劑為HPLC級、乙二胺四乙酸二鈉等為分析純、流動相HPLC級。

1.4 原理

試樣中四環素族藥物殘留量用0.1mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液提取，經過濾和離心后，上清液用PLS固相萃取柱凈化，液相色譜串聯質譜儀測定，外標峰面積法定量。

2 試樣

（1）試樣制備將抽取的樣品充分混勻，均分成兩份，分別裝入潔凈的容器中，密封、標記、-18℃冷凍保存，以備測試。

（2）提取：稱取試樣2 g（精確至0.01g），置于50 mL具塞塑料離心管，加入濃度為100 ng/mL的混合內標標準溶液100 μL，在加標樣品中加入濃度為100 ng/mL的混合標準溶液100 μL，加入5 mL0.1mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液和5mL甲醇漩渦混合1min，6000r/min離心5 min，合并上清液與50 mL容量瓶中，再分兩次用約10 mL0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液冰水超聲提取兩次，每次漩渦混合1 min，6000 r/min離心5 min，合并上清液，并定容至50 mL，混勻，取25 mL溶液至離心管用PH計調節pH至6.0。

（3）凈化：將上述樣品溶液加至已活化的PLS柱，待樣液完全流出后，依次用6 mL水和6 mL甲醇：水（1：19）淋洗，棄去全部流出液。2.0 kPa以下減壓抽干5min，最后用10 mL甲醇洗脫。將洗脫液氮吹濃縮至干（溫度低于40 ℃），用1.0 mL甲醇：水=1：9（含0.15%甲酸）溶解殘渣，過0.45 um濾膜，待測定。

3 儀器參數與測定條件

3.1 色譜測定條件

（1）色譜柱：Eclipse Plus C18， 3.5μm，2.1×100 mm（內徑）。（2）梯度洗脫條件。（3）流速：0.25 mL/min。（4）進樣量：20 μL。（5）柱溫：40℃f）流動相：A：0.3%甲酸 B：乙腈表 梯度洗脫條件。

3.2 定量方法

用色譜工作站建立標準工作曲線，樣品采用工作曲線定量。

3.3 樣品加標回收率實驗

蜂王漿中四環素測定的回收率范圍和精密度（n=6檢測限、測定低限、線性范圍、回收率范圍和精密度。本方法對于蜂王漿中四環素藥物殘留的測定低限（LOQ）為10 μg/kg，線性范圍為10～50.0 ng/mL。

4 結果計算

按式（1）計算試樣中含量。

（1）

式中：

X—試樣中的殘留量，單位為毫克每千克（mg/kg）；

C—由標準工作曲線得到樣液中的濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；

V—樣液最終體積，單位為毫升（mL）；

m—最終樣液所代表的試樣量，單位為克（g）。

4.1 檢測質量控制標準

質控樣品為空白樣品添加，添加水平為0.5 μg/kg，回收率范圍為80%～110%。標準工作溶液線性范圍為4～50.0 μg/mL，相關系數大于0.88。稱取5g（精確到0.01 g）蜂王漿空白樣品，加入濃度100 ng/mL的混合標準溶液200 μL，按照上述實驗方法，測定添加樣品中四環素的含量。空白溶液及其添加50 μg/kg標準溶液所得色譜圖。

5 結論

針對不同狀態的蜂王漿（干粉和鮮王漿）采用高效液相色譜法和高效液相串聯質譜法對四環素類抗生素檢測，得出如下結論。

該方法可以用于干粉和鮮王漿中四環素類抗生素及代謝物檢測，回收率88.0%～102.0%，目標代謝物有良好的回收率。

對不同狀態的蜂王漿的檢測，本方法對于蜂王漿中四環素藥物殘留的測定低限（LOQ）為10 μg/kg，線性范圍為10 μg/mL～50.0 μg/mL，符合產品質量安全標準要求。

該方法具有較高靈敏度，適用相對較廣，檢測時間，前處理簡便。

參考文獻

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