石斛合劑調控老年糖尿病大鼠GLP-1的研究*

劉 赟，施 紅，林心君，鄭曉玲，許 茜

（福建中醫藥大學，福州 350122）

胰高血糖素樣多肽-1（GLP-1）是在回腸與結腸的L細胞產生的一種腸促胰素，其受體分布在胰島α、β細胞、周圍神經系統、胃腸道和心、腎、肺等重要器官[1]。GLP-1除了能抑制β細胞凋亡以外，還能促進胰島β細胞增殖和再生，促進胰島素，胰高血糖素的分泌等[2-3]。因此其在治療糖尿病（DM）的領域越來越引起人們的重視。本研究通過測定不同時間段血清GLP-1的濃度，探討石斛合劑（DC）通過調控GLP-1治療DM的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 雌性Wistar大鼠,SPF級，67只，體質量（220±30）g。

1.2 藥物 石斛合劑藥物組成：石斛、黃芪、五味子、丹參、葛根、玄參等。低、高劑量生藥含量分別為：2、4 g/mL，滅菌后100 mL分裝1瓶，分裝保存備用。二甲雙胍緩釋片配制濃度：5 g/L，備用。

1.3 試劑 烏拉坦（氨基甲酸乙酯），大鼠GLP-1測定試劑盒等。

1.4 造模方法，實驗分組及給藥

1.4.1 造模 適應性喂養7d后，將大鼠按隨機數字表法隨機分為兩組:正常組13只、造模組54只。根據前期研究,正常組給予基礎飼料喂養，造模組給予高脂高糖飼料。1 a后，造模組按20 mg/kg腹腔注射鏈脲菌素（STZ）。3 d后篩出成模大鼠（血糖≥16.7 mmol/L），剩余大鼠再次腹腔注射STZ、檢測血糖，選出成模大鼠。

1.4.2 實驗分組及給藥 采用隨機數字表法隨機將成模大鼠分為正常組（13只）、模型組（15只）、DC低劑量組（14只）、DC高劑量組（12只）、對照組（13只）。正常組、模型組予生理鹽水灌胃，對照組予二甲雙胍50 mg/（kg·d）灌胃，DC低、高劑量組按生藥量分別予DC 12 g/（kg·d）、24 g/（kg·d）灌胃，24 d后取材。

1.5 觀察指標及檢測方法 大鼠剪尾，酶聯免疫吸附法（ELASA法）檢測大鼠0.5、2.5 h血清GLP-1。處死，取小腸，免疫組化方法檢測大鼠小腸GLP-1。

2 結果

2.1 石斛合劑對糖耐量實驗后0.5、2.5 h大鼠血清GLP-1水平及其差值的影響 見表1。

通過監測糖耐量實驗后0.5 h以及2.5 h GLP-1水平發現，0.5 h GLP－1結果顯示：與模型組比較，DC低劑量組無統計學差異（P＞0.05），DC高劑量組顯著高于模型組（P＜0.01）。2.5 h GLP-1結果顯示:與模型組比較，DC低劑量組、DC高劑量組無統計學差異（P＞0.05）。0.5 h與2.5 h GLP-1水平的差值比較：與模型組比較，DC低劑量組低于模型組（P＜0.05），DC 高劑量組顯著高于模型組（P＜0.01）。

表1 糖耐量實驗后0.5、2.5 h大鼠血清GLP-1水平及差值的比較（s）pmol/L

表1 糖耐量實驗后0.5、2.5 h大鼠血清GLP-1水平及差值的比較（s）pmol/L

注:與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

?

2.2 石斛合劑對大鼠GLP-1水平的影響 見圖1。

圖1 小腸GLP-1免疫組化圖片(×200)

通過觀察小腸GLP-1免疫組化圖片發現，正常組、模型組、對照組、DC低劑量組、DC高劑量組都未見陽性表達。正常組小腸腸上皮排列整齊，腸腺未見陽性表達，腸絨毛固有層可見部分黃褐色，為血液污染；模型組小腸固有層內空泡明顯增多，腸腺未見陽性表達，腸絨毛固有層可見部分黃褐色，為血液污染；對照組、DC高、低劑量組小腸固有層內空泡較正常組有所增多，腸腺未見陽性表達，腸絨毛固有層可見部分黃褐色，為血液污染。

3 討論

隨著社會經濟的發展和生活方式的改變，糖尿病的患病率呈上升趨勢，成為危害人類健康的全球性問題。中醫認為2型糖尿病病位在脾（胃）、肝、腎為主，涉及心肺，陰虛或氣陰兩虛為本，痰濁血瘀為標，多虛實夾雜[4-6]。初期為情志失調，痰濁化熱傷陰，以標實為主。繼之為氣陰兩虛，最后陰陽兩虛，兼夾痰濁瘀血，以本虛為主[7-9]。基礎研究發現，石斛合劑基礎方能使細胞內溶酶體活性增強，自噬途徑的胞內降解增加，從而使高血糖大鼠模型肝、腎的自噬表達增強[10]。另外，細胞培養顯示含石斛合劑基礎方的血清能保護胰島細胞并減輕STZ對胰島細胞的損傷[11]。還有報道表明石斛合劑能促進GLP-1、胰島素分泌，抑制胰高血糖素分泌，逆轉糖尿病動物延遲的血糖高峰、改善胰腺等組織結構，改善糖脂代謝的作用，能抑制胰腺凋亡相關基因P53、Bax mRNA及蛋白表達等作用[12-14]。

本實驗采用石斛合劑對大鼠進行近1個月的治療發現，通過監測糖耐量實驗后0.5 h以及2.5 h GLP-1水平發現，0.5 h GLP－1結果顯示：與模型組比較，DC低劑量組無統計學差異（P＞0.05），DC高劑量組顯著高于模型組（P＜0.01）。2.5 h GLP-1結果顯示:與模型組比較，DC低劑量組、DC高劑量組無統計學差異（P＞0.05）。0.5 h與2.5 h GLP-1水平的差值比較：與模型組比較，DC低劑量組低于模型組（P＜0.05），DC 高劑量組顯著高于模型組（P＜0.01）。通過觀察小腸GLP-1免疫組化圖片發現，正常組、模型組、對照組、DC低劑量組、DC高劑量組都未見陽性表達。正常組小腸腸上皮排列整齊，腸腺未見陽性表達，腸絨毛固有層可見部分黃褐色，為血液污染；模型組小腸固有層內空泡明顯增多，腸腺未見陽性表達，腸絨毛固有層可見部分黃褐色，為血液污染；對照組、DC高、低劑量組小腸固有層內空泡較正常組有所增多，腸腺未見陽性表達，腸絨毛固有層可見部分黃褐色，為血液污染。未發現GLP-1陽性表達的原因可能是因為GLP-1在體內的代謝比較快，半衰期僅1～2 min，故用免疫組化的方法比較難檢測出。

綜上所述，低劑量DC組雖然不能使大鼠0.5 h及2.5 h GLP-1水平顯著提高，但是通過比較這兩個時間段GLP-1水平，發現GLP-1水平下降很少，與模型組有統計學差異（P＜0.05）；而高劑量DC組能使大鼠0.5 h GLP-1水平顯著提高，與模型組有統計學差異（P＜0.01）。DC低劑量組呈現減少GLP-1降解，而DC高劑量組則更多呈現促進GLP-1分泌，說明低劑量DC可能是通過在一定時間內，抑制雌性SD大鼠體內GLP-1降解而達到降血糖的作用；高劑量DC則可能是通過增加GLP-1水平而達到降血糖的目的。

[1]余文珍,施 紅,鄭燕芳,等.石斛合劑對衰老糖尿病大鼠血清GLP-1水平的影響[J].海南醫學院學報,2006,12(3):196-199.

[2]Beckman LM,Beckman TR,Earthman CP.Changes in gastrointestinal hormones and leptin after Rouxen-Y gastric bypass procedure：a review[J].J Am Diet Assoc,2010,110(4):571-584.

[3]鄭遠燕,施 紅,崔 乙.GLP-1調控胰島細胞增殖、凋亡的信號分子機制及中西藥的研究[J].世界中醫藥,2012,9(7):463-466.

[4]賈 明,賈德林,于 陽,等.賈德林教授關于糖尿病并發冠心病中醫病機新理論簡介[J].天津中醫藥大學學報,2008,27(4):250-251.

[5]栗德林,閆秀峰.糖冠康膠囊治療2型糖尿病合并冠心病的臨床與機制研究[J].中醫藥學報,2003,31(1):11-12.

[6]楊彩鳳,曹 茜,沈永明.2型糖尿病中醫證候研究進展[J].天津中醫藥大學學報,2008,27(2):106-109.

[7]馮連笑.活血通絡法治療糖尿病周圍神經病變研究概況[J].天津中醫藥,2011,28(5):438-440.

[8]王慶向.養陰溫腎活血法治療糖尿病腎病臨床觀察[J].天津中醫藥,2010,27(2):105-106.

[9]周 暉,商學征,謝培鳳,等.益氣養陰解讀通絡法治療早期糖尿病腎病的臨床研究[J].天津中醫藥,2009,26(2):100-102.

[10]鄭雪花,錢長暉,何才姑.石斛合劑對糖尿病大鼠腎臟自噬表達的影響[J].福建中醫學院學報,2010,20(1):27-28.

[11]鄭燕芳,施 紅,楊秀珍.石斛合劑對胰島細胞分泌功能的影響[J].中國醫院藥學雜志,2010,30(7):551-552.

[12]林 雅,施 紅,余文珍,等.石斛合劑對四氧嘧啶糖尿病大鼠影響的實驗研究[J].福建中醫學院學報,2005,15(2):30-33.

[13]余文珍,施 紅,鄭燕芳,等.石斛合劑對糖尿病大鼠血清GLP-1水平的影響[J].海南醫學院學報,2006,12(3):196-199.

[14]施 紅,金國琴,高尤亮,等.石斛合劑對衰老糖尿病大鼠胰腺組織凋亡相關基因Bax，Bcl-2 mRNA及蛋白表達的調控[J].中國老年學雜志,2006,16(1):57-59.