血清含量對HaCaT細胞生長特性及遷移能力的影響*

張澤曦，李墨靈，杜天樂，夏慶梅，張　晗

·學生園地·

血清含量對HaCaT細胞生長特性及遷移能力的影響*

張澤曦，李墨靈，杜天樂，夏慶梅，張晗

（天津中醫藥大學，天津300193）

［目的］考察不同血清含量以及培養不同時間對人永生化角質形成細胞（HaCaT）細胞的生長及遷移特性的影響，為HaCaT細胞劃痕實驗條件優化提供實驗數據支撐。［方法］培養HaCaT細胞，按10%血清濃度全培基（全培基陽性對照組）、2%低濃度血清培基（低血清培基組）及無血清培基（對照組）分組，通過進行細胞劃痕實驗，CCK-8細胞活力檢測、Brdu細胞增殖實驗，分析HaCaT生長特性。［結果］在24 h內，低血清培基組HaCaT細胞與全培基組相比，細胞增殖能力無明顯差異，細胞活力有增高的趨勢。細胞孵育48 h后，全培基組細胞增殖能力及活力明顯升高。24～48 h，全培基組細胞增殖能力及細胞活力的提升速度明顯高于低血清培基組。［結論］培養基中血清含量對HaCaT細胞生長特性及遷移能力具有重要影響，培養24 h內低血清培養條件有利于劃痕實驗的觀察與測定。

HaCaT細胞；劃痕實驗；創傷修復；方案優化

角質形成細胞是人表皮的兩大類主要組成細胞之一。人永生化角質形成細胞（HaCaT細胞）是由成人表皮細胞自發轉化而來的細胞系，具有永生性，并與角質形成細胞具有相似的增殖、分化特性，遺傳特性穩定［1］，是現代生物醫學實驗中常使用的一種細胞系。國內外學者常將該細胞系應用于治療各類皮膚病的藥物實驗研究中，包括皮膚修復愈合、銀屑病、防曬等研究［2-3］。創傷修復是一個涉及表皮角質形成細胞、成纖維細胞等多種類型細胞間相互作用以及多個病理生理反應機制的復雜過程［4-5］。因此，很多人也將HaCaT細胞應用于有關皮膚燒傷后創傷修復的研究：研究促進創面修復的因素［6］，HaCaT細胞過度增殖而引起的創傷后創面過再生的問題［7］，以及利用HaCaT細胞為種子細胞構建新型人組織工程皮膚［8］。

細胞劃痕實驗是一種操作簡單的研究細胞遷移的體外實驗方法，在一定程度上模擬了體內細胞遷移的過程，是研究創傷愈合的常用檢測方法之一［9-10］。創傷愈合是細胞遷移和增殖共同作用的結果，在實際細胞劃痕實驗中，研究者為觀察藥物對細胞遷移的作用，常采用低血清培養條件，以降低細胞增殖能力，減少血清對藥物作用的干擾。應用人永生化角質形成細胞HaCaT進行劃痕實驗研究發現，在2%低血清培基孵育細胞24 h后與全培基組相比劃痕損傷愈合趨勢更為明顯，繼續培養24 h后，全培基組劃痕愈合率明顯高于低血清培基組。在此基礎上，通過培養HaCaT細胞，進行CCK-8細胞活力檢測、Brdu增殖實驗，考察不同血清含量以及培養不同時間對HaCaT細胞的生長及遷移特性影響，為HaCaT細胞劃痕實驗條件優化提供實驗數據支撐，現將對此研究報道如下。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1細胞人永生化角質形成細胞（HaCaT），購自北京協和細胞庫。

1.1.3細胞培養試劑與檢測試劑 MEM/eb（sHyClone）、胎牛血清（BI）、雙抗（HyClone青霉素+鏈霉素，青霉素10 000 U/mL，鏈霉素10 000 μg/mL）、胰酶（0.25%胰蛋白酶+0.125%EDTA、BI）、BrdU試劑（羅氏）、CCK-8檢測試劑盒（Dojindo）。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養與分組HaCaT細胞以2×105cells/cm2接種于25 cm2的培養瓶中，在溫度37℃和5%二氧化碳的環境下，用含10%胎牛血清和1%雙抗的MEM/ebs培基培養。當細胞貼滿瓶底90%～100%時，使用胰酶傳代。將HaCaT細胞分別接種于10%血清濃度全培基（全培基陽性對照組，10%FBS組）、2%低濃度血清培基（低血清培基組，2%FBS組）及無血清培基（對照組，0%FBS組）的24或96孔板中培養用于后續實驗。

1.2.2細胞劃痕實驗按每孔3×104細胞濃度接種HaCaT細胞于96孔板，待板中的細胞貼壁90%以上，更換無血清培基，16 h后，將細胞如上分組，使用細胞劃痕器進行細胞劃痕，并繼續培養，分別在24、48 h鏡下觀察照相比較，計算劃痕損傷面積愈合率。

1.2.3CCK-8法活力檢測按每孔3×104細胞濃度接種HaCaT細胞于96孔板，待板中的細胞貼壁70%，更換無血清培基，16 h后按如上分組，培養24 h和48 h后每孔加入100 μL的10%CCK-8試劑，溫箱孵育30 min后用酶標儀檢測A值。

1.2.4Brdu增殖實驗以每孔3×104細胞接種HaCaT細胞于96孔板，待板中的細胞貼壁70%，待板中的細胞貼壁70%以上，更換無血清培基同步化培養16 h，按如上分組，24 h和48 h后，依照BrdU試劑盒說明書操作檢測，在450 nm處測量A值。

2　實驗結果

2.1細胞劃痕實驗細胞劃痕培養24 h后，無血清培基組面積愈合率為（17.07±6.15）%，低血清培基組面積愈合率為（40.19±4.7）%，全培基組面積愈合率為（37.94±4.2）%。無血清培基組與全培基組、低血清培基組相比存在明顯差異（P＜0.01）。細胞劃痕培養48h后，無血清培基組面積愈合率為（19.95±6.6）%，低血清培基組面積愈合率為（44.68±5.17）%，全培基組（62.37±3.69）%，無血清培基組與低血清培基組、全培基組相比存在顯著差異（P＜0.01）。低血清培基組與全培基組相比，存在明顯差異（P＜0.01）。見圖1。

2.2CCK-8細胞活力檢測細胞孵育24 h后，無血清培基組A值為（0.58±0.03），低血清培基組A值為（0.68±0.05），全培基組A值為（0.62±0.03）。24 h檢測，低血清培基、全培基組與無血清培基組相比存在差異（P＜0.05），低血清培基組與全培基組相比存在差異（P＜0.05）。細胞孵育48 h后，無血清培基組A值為（0.63±0.08），低血清培基組A值為（0.73± 0.03），全培基組A值為（0.88±0.05）。低血清培基組、全培基組與無血清培基組相比，均存在顯著差異（P＜0.01）。低血清培基組與全培基組相比存在顯著差異（P＜0.01）。與24 h相比，48 h的無血清培基組細胞平均活力增長了9%，低血清培基組細胞平均活力增長了7%，全培基組細胞平均活力增長了42%。24～48 h，全培基組細胞活力明顯高于低血清培基組和無血清培基組。見表1、圖2。

圖1　不同培基對HaCaT細胞劃痕的影響

表1　不同培基對HaCaT細胞活力的影響

表1　不同培基對HaCaT細胞活力的影響

注：與24 h的0%FBS相比，*P＜0.05；與24 h的10%FBS組相比，#P＜0.05；與48 h的0%FBS組相比，△P＜0.01；與48 h的10%FBS組相比，▲P＜0.01。

組別0%FBS組2%FBS組10%FBS組n 6 6 6 6 6 6時間（h）　CCK-8 A值24　0.58±0.030 48　0.63±0.080* 24　0.68±0.050*#48　0.73±0.030△▲24　0.62±0.038 48　0.88±0.050△

圖2　不同培基對HaCaT細胞活力的影響

2.3Brdu實驗細胞孵育24 h后無血清培基組吸光度為（1.13±0.28），低血清培基組吸光度為（1.58± 0.14），全培基組吸光度（1.48±0.06），與無血清培基組相比、低血清培基組、全培基組間均存在明顯差異（P＜0.01）。細胞孵育48 h后無血清培基組吸光度為（1.20±0.14），低血清培基組吸光度為（1.73±0.12），全培基組吸光度為（1.87±0.11）。與24 h相比，48 h的無血清培基組細胞增殖率平均值提高了6%，低血清培基組細胞增殖率平均值提高9%，全培基組細胞增值率平均值提高了26%。24～48 h，全培基組細胞增殖能力提高速度明顯高于低血清培基組和無血清培基組。見表2、圖3。

表2　不同培基對HaCaT細胞增殖能力的影響

表2　不同培基對HaCaT細胞增殖能力的影響

注：與孵育24 h的0%FBS相比，*P＜0.01；與孵育48 h的0% FBS組相比，#P＜0.01。

組別0%FBS組2%FBS組10%FBS組n 6 6 6 6 6 6時間（h）　CCK-8 A值24　1.13±0.28 48　1.20±0.14 24　1.58±0.14* 48　1.73±0.12#24　1.48±0.068 48　1.87±0.11#

圖3　不同培基對HaCaT細胞增殖能力的影響

3　結論與討論

在本研究中，采用HaCaT細胞進行細胞劃痕、CCK-8細胞活力檢測、Brdu增殖實驗，結果顯示：在24 h內，低血清培基組HaCaT細胞與全培基組相比，細胞增殖能力無明顯差異，細胞活力有增高的趨勢。隨著孵育時間的延長，細胞孵育48 h后，全培基組細胞增殖能力及細胞活力明顯升高，其增殖速率明顯高于低血清培基組。

細胞劃痕實驗常用于檢測藥物對皮膚角質、成纖維細胞，血管內皮、平滑肌細胞，神經元以及腫瘤細胞的遷移或侵襲能力［11-12］，是考察細胞運動能力的常用實驗之一［13-14］。在劃痕實驗操作方法中，常推薦研究者采用無血清或低血清培養條件，減少血清對細胞增殖的影響［15-16］。但實驗中，若只研究藥物對細胞遷移能力的影響，同時考慮到藥物孵育時間（24～72 h），研究者常采用低血清培養條件，以期降低細胞增殖能力，減少變量干擾的同時保證細胞正常的存活狀態。本研究發現，劃痕24 h后，低血清培基孵育細胞與全培基組相比劃痕損傷愈合趨勢更為明顯，同時CCK-8和Brdu實驗結果也證實低血清培基組與全培基組相比在24 h并不能抑制細胞增殖能力，且細胞活力較全培基組有升高的趨勢。出現這種現象考慮可能有兩種原因：1）低血清濃度的培基可能使該細胞產生代償性增殖［17］。2）在24 h內，低血清培基中的營養與生長因子可能負擔其增殖所需，而隨著細胞增殖到一定數量，低血清培基的營養與生長因子已經不足以負擔該細胞繼續增殖。因此隨著培養時間的延長，低血清培基組細胞的增殖速率逐漸下降。在培養48 h后，全培基組顯示其劃痕愈合率明顯高于低血清培基組，全培基組細胞增殖能力與活力明顯升高，其增殖速率明顯高于低血清培基組。根據考察藥物作用的不同以及藥物孵育時間的長短，應重視無血清或低血清培養條件的選擇。絲裂霉素（MMC）具有抑制成纖維等細胞分裂增殖的能力［18］，是劃痕實驗中經常使用的細胞增殖抑制劑之一［19-20］。在實驗中，若只考察藥物短時間內（24 h以內）對細胞遷移能力的影響，采用無血清培養條件可能較為適宜，或者考慮加入適量絲裂霉素。

上述研究提示，雖然劃痕實驗是一種操作簡單，普遍使用的經典實驗方法，但在實際的操作過程中仍應根據實驗目的、細胞狀態、藥物選擇與孵育時間等因素選擇適宜的實驗條件，調整實驗方法，從而得到更穩定準確科學的實驗結果。培養基中血清含量對HaCaT細胞生長特性及遷移能力具有重要影響，選擇適宜血清培養條件有利于劃痕實驗觀察與測定。

［1］Boukamp P，Petrussevska RT，Breitkreuz D，et al.Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line［J］.J Cell Biol，1988，106（3）: 761-71.

［2］閆小溪.銀肩病經典方劑含藥血清對白介素22誘導HaCaT細胞增殖的影響［D］.北京:北京中醫藥大學，2014.

［3］駱丹，林向飛，徐晶，等.3種中藥對中波紫外線輻射HaCaT細胞的干預及其機制［J］.中國藥理學通報，2007，23（6）:750-755.

［4］Komarcevic A.The modern approach to wound treatment［J］. Med Pregl，2000，53（7-8）:363-368.

［5］Gurtner GC，Werner S，Barrandon Y，et al.Wound repair and regeneration［J］.Nature，2008，453:314-321.

［6］楊世偉.一氧化氮對HaCat細胞遷移功能的影響及機制研究［D］.重慶:第三軍醫大學，2010.

［7］王玉玲.梓醉、左旋紫草素、丹皮酚對KGF誘導的HaCaT細胞過度增殖的影響［D］.北京:北京中醫藥大學，2011.

［8］朱崇濤，彭代智，周新，等.以HaCaT細胞為種子細胞構建新型人組織工程皮膚［J］.現代生物醫學進展，2007，7（6）: 817-829.

［9］張玲，黃道斌，呂俊，等.N-（4-羥基苯基）維生素甲酰胺抑制人肺腺癌A549細胞體外遷移機制［J］.安徽醫科大學學報，2014，49（2）:137-140.

［10］孟文霞，劉傳霞，高慶紅，等.TGF-β1對口腔癌相關成纖維細胞遷移特性的影響［J］.口腔醫學研究，2013，28（8）: 707-709.

［11］聶少麟.miRNA-25靶向調控ANGPTL2抑制結腸癌細胞增殖和侵襲的研究［D］.長沙:中南大學，2014.

［12］趙逾涵.MTDH在脂多糖促進乳腺癌遷移侵襲中作用的研究［D］.濟南：山東大學，2012.

［13］Inderjit Daphu，Sindre Horn，Daniel Stieber，et al.In Vitro Treatment of Melanoma Brain Metastasis by Simultaneously Targeting the MAPK and PI3K Signaling［J］.Pathways Int J Mol Sci，2014，15（5）:8773-8794.

［14］Cory G.Scratch-wound assay［J］.Methods Mol Biol，2011，769:25-30.

［15］CThompson C，Ashcroft FJ，Patel S，et al.Pancreatic cancer cells overexpress gelsolin family-capping proteins，which contribute to their cell motility［J］.Gut-BMJ，2007，56:95-106.

［16］趙麗陽.siRNA沉默ASPP2基因對人角質形成細胞HaCaT細胞遷移和增殖的影響［D］.太原：山西醫科大學，2014.

［17］蔣艷玲.125二羥維生素D3對HaCaT細胞增殖活性的影響及其表觀遺傳調控機制研究［D］.長沙:中南大學，2012.

［18］王大博，紀淑興，王竫華.絲裂霉素C抗增殖作用的實驗研究［J］.眼科新進展，2002，22（2）:106-108.

［19］韓林，關東博，杜習金，等.原花青素對人表皮細胞株HaCaT增殖功能的影響［J］.口腔醫學研究，2013，28（9）: 806-809.

［20］蔣艷.富組蛋白1促進人表皮細胞，人成纖維細胞增殖和遷移在創傷愈合中的作用及機制研究［D］.重慶:第三軍醫大學，2012.

Effect of serum content on the growth characteristic in the HaCaT cells

ZHANG Ze-xi，LI Mo-ling，DU Tian-le，XIA Qing-mei，ZHANG Han
（Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］By studying the growth characteristic of the HaCaT cells in conditions of the serum free medium，low serum medium and the serum medium.Put forward the optimization scheme of the HaCaT Wound scratch assay.［Methods］Culture HaCaT cell，grouped into 10%serum medium（positive control group），2%low serum prudential（low serum prudential group）and serum free prudential（control group），through the HaCaT wound scratch assay，CCK-8 assay，Brdu assay，analysis the HaCaT growth characteristics.［Results］With in 24 h，low serum prudential group HaCaT cells compared with the positive control group，no difference between the cell proliferation，cell vitality had increase tendency，incubation cells after 48 h，positive control group cell proliferation ability and cell viability higher than low serum prudential group.Between 24 h and 48 h，10%serum medium positive control group cell proliferation ability and speed of cell viability was obviously higher than that of low serum prudential group.［Conclusion］If it is only in the actual experiments，study drug in a short period of time（within 24 h）on HaCaT cell migration ability，the influence of culture in serum-free conditions may be more appropriate.

HaCaT cell；wound scratch assay；wound healing；optimization experiment

R285.5

A

1673-9043（2015）06-0369-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2015.12.14

大學生科技創新基金（CXJJ2012C02）；國家自然基金（81373789）。

張澤曦（1993-），男，天津中醫藥大學中醫學院2011級學生。

張晗，E-mail：zhanghan0023@126.com。

（2015-08-15）