甲魚復合肽對腫瘤放療的輔助作用研究*

★ 付劍江譚松林李詒光呂紅朱衛豐劉紅寧*（.江西中醫藥大學 南昌330004；.江中藥業股份有限公司技術中心 南昌 330096）

甲魚復合肽對腫瘤放療的輔助作用研究*

★ 付劍江1**譚松林1李詒光2呂紅1朱衛豐1劉紅寧1***（1.江西中醫藥大學 南昌330004；2.江中藥業股份有限公司技術中心 南昌 330096）

目的：研究甲魚復合肽對腫瘤放療的輔助作用。方法：采用人體胃癌細胞株BGC-823細胞皮下移植的方法，建立裸鼠移植瘤模型，從鈷源放射治療的抗腫瘤作用、荷瘤動物化療后的總體生存狀況、化療藥物所致白細胞減少以及骨髓抑制等方面，考察甲魚復合肽對放療的輔助作用。結果：甲魚復合肽對放射治療的抗腫瘤作用沒有明顯影響，與鈷源單獨照射組相比，甲魚復合肽與鈷源照射聯合治療組動物的瘤塊體積和重量無統計學差異（P＞0.05）。甲魚復合肽可顯著減輕鈷源照射的毒副作用。與鈷源單獨照射組相比，甲魚復合肽高（20.8g/kg）、中（10.4g/kg）劑量組動物體重顯著增加（P＜0.01）；甲魚復合肽還可改善鈷源照射所致的骨髓抑制，其骨髓有核細胞DNA含量顯著增加（P＜0.01），但甲魚復合肽對放療裸鼠的外周血白細胞數無顯著影響（P＞0.05）。另外，甲魚復合肽還可顯著改善荷瘤動物經大劑量放射治療后的生存率，動物的平均存活時間和存活率均顯著提高（P＜0.05）。結論：甲魚復合肽對放射治療的抗腫瘤作用沒有明顯的促進作用，但可以減輕放射治療的毒副作用。

甲魚復合肽；放療；減毒增效作用；鈷-60

惡性腫瘤的治療是一個復雜而棘手的問題，目前臨床常用的手段包括手術、化療和放療。且放療仍然是腫瘤治療的重要手段，約70%的患者在不同的治療階段需要進行放療，其臨床作用日益突出。但是腫瘤放療所產生的骨髓抑制、免疫抑制等方面的毒副作用以及對患者生活質量所造成的影響，也成為影響其療效的重要原因之一。近年來，隨著人們對惡性腫瘤認識的逐漸深入，腫瘤放射治療也取得了較大進展，因此如何進一步提高療效，延長患者生存期，改善患者的生活質量，解決放療中存在的問題，是當前的一個研究熱點。本研究從減毒和增效兩方面入手，就甲魚復合肽特殊膳食的放療輔助作用進行系統研究。

1 材料

1.1 藥品與試劑 甲魚復合肽（snapping turtle Copeptide，STCP）由江中藥業股份有限公司提供，批號20100909，用前用滅菌蒸餾水配制成每毫升相當于甲魚復合肽10.4g的母液，實驗前用滅菌蒸餾水配制成每毫升相當于甲魚原料10.4g的母液；DMEM高糖培養基（Gibico公司）。

1.2 細胞株 人體胃癌細胞株BGC-823，購自中國醫學科學院細胞庫，由江西中醫藥大學藥理學科組傳代、保管。

1.3 實驗動物 Balb/C Nu裸鼠，雄性，18～22g，由北京大學醫學部實驗動物科學部提供，合格證號0250262。

1.4 主要儀器 NanoVue微量蛋白核酸儀（GE公司）；AL204電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；XT-200I型血細胞分析儀（日本西斯美康公司）；數顯游標卡尺（滄州冀路試驗儀器公司）；200萬居里鈷源（江西科苑輻照技術開發有限公司）。

2 方法

2.1 細胞培養 BGC-823細胞在含有10%胎牛血清、100 U/L青霉素、100μg/mL鏈霉素的DMEM培養液中，于37℃、5%CO2、飽和濕度環境下常規培養。當細胞生長至對數生長期時，用胰蛋白酶溶液消化細胞。

2.2 人體胃癌裸鼠移植瘤模型的建立 雄性4～6周齡BALB/C/Nu裸鼠，于背部皮內接種BGC-823人胃癌細胞1×107/只，當腫瘤體積長至1 cm3左右時，無菌條件下取下部分瘤塊，切成1mm3左右的小塊，用套管針接種到實驗裸鼠背部皮下，形成皮下移植瘤。

2.3 STCP對放射治療的減毒和增效作用研究 上述腫瘤移植小鼠在接種48 h后隨機分為5組：A.空白對照組：只灌胃給予等體積溶劑；B.60Co照射組：分別于分組后第15d、22d和29d經60Co全身照射，照射劑量為3.5Gy，劑量率為0.70Gy/min；C.60Co+高劑量STCP組：60Co全身照射的劑量和時間同B組；STCP灌胃給予，劑量為20.8g/kg/d，自分組之日開始給藥，連續灌胃35d，每天1次。D.60Co+中劑量STCP組：60Co全身照射的劑量和時間同B組；STCP灌胃給予，劑量為10.4g/kg/d，自分組之日開始給藥，連續灌胃35d，每天1次。E.60Co+低劑量STCP組：60Co全身照射的劑量和時間同B組；STCP灌胃給予，劑量為5.2g/kg/d，自分組之日開始給藥，連續灌胃35d，每天1次。上述各組動物每周兩次測量腫瘤體積,繪制生長曲線，末次給藥24h后結束實驗，剝離腫瘤組織稱重并計算腫瘤抑制率。

為了解STCP對60Co放射治療的減毒作用，上述荷瘤在末次給予STCP 24h后眼眶靜脈叢采血，全自動血細胞分析儀檢測小鼠外周血細胞，測定血中白細胞計數。

2.4 骨髓DNA含量測定 參照文獻[1]的方法，剝離出完整股骨，用1mL注射器吸取一定量Hank’s液，沖出股骨中全部骨髓細胞；最后1000Xg，離心5 min，棄上清。加入一定量PBS溶液洗滌后離心，加入180μL PBS溶液，充分混勻，懸浮細胞。隨后采用Easy－PureTM DNA提取試劑盒（TransGene BioTech，北京）提取骨髓細胞內的DNA，最后用溶解緩沖液將樣品精確定容為300μL用于測定DNA含量。

2.5 STCP對荷瘤動物存活率的影響 上述腫瘤移植小鼠在接種48 h后隨機分組，分組方法同2.3，只是60Co的照射劑量和次數以及STCP的給藥周期有所不同：60Co的照射方案為自接種后第29d起，將小鼠置于自制射線暴露盒內，用60Co照射，每天1次，連續7d。每次吸收劑量2.0Gy，劑量率為0.4Gy/min，總吸收劑量為14Gy；各劑量組STCP的給藥方案為自接種后第8d開始灌胃給藥，給藥周期為60d，各劑量組的劑量與2.3一致。上述各組動物每周測量腫瘤體積1次,繪制生長曲線，60d后結束實驗，觀察并比較各組動物在60d內的平均存活時間、存活動物數并記錄動物的大體狀況。

3 結果

3.1 STCP和60Co源照射聯合治療對腫瘤生長的影響圖1所示為STCP和鈷源照射聯合治療后人胃癌裸鼠移植瘤的生長情況。從圖中可知，STCP與鈷源照射聯合治療后，腫瘤的生長受到一定抑制，但與空白對照組相比無統計學意義。與鈷源照射單獨治療組相比，聯合治療高、中、低劑量組的瘤體積和瘤重沒有顯著差異（P＞0.05）。

圖1 STC P和鈷源照射聯合治療對人胃癌裸鼠移植瘤生長的影響

3.2 STCP和60Co源照射聯合治療對荷瘤動物體重的影響 圖2中所列為STCP與鈷源照射聯合治療后裸鼠體重的變化情況。從圖中可知，荷瘤裸鼠在接受鈷源照射之后，動物體重下降，且顯著低于空白組。與鈷源照射組相比，在接受鈷源照射的同時給予STCP后，各劑量組動物的體重均有所增加，其中中劑量和高劑量STCP組與鈷源單獨照射組之間存在顯著差異（P<0.05）。

圖2 STC P與鈷源照射聯合治療對動物體重的影響

3.3 STCP和60Co聯合治療對荷瘤動物外周血白細胞的影響 見表1。荷瘤裸鼠在接受鈷源照射后外周血白細胞數目顯著降低，與鈷源單獨照射組相比，高、低劑量STCP組動物外周血白細胞數目有一定提高，但無統計學意義（P＞0.05）。

表1 STCP對放射治療荷瘤裸鼠外周血白細胞數的影響（±s,n=20)

表1 STCP對放射治療荷瘤裸鼠外周血白細胞數的影響（±s,n=20)

組別 劑量 WBC /109·mL-1空白對照組 --? 16.63±5.07鈷源照射組 3.5Gy/周 7.09±3.28**STCP高劑量組 20.8g/kg 7.79±2.18**STCP中劑量組 10.4g/kg 6.93±2.51**STCP低劑量組 5.2g/kg 7.17±2.79**

3.4 STCP和60Co聯合治療對荷瘤動物骨髓DNA含量的影響 表2所示為STCP與鈷源照射聯合治療對荷瘤裸鼠骨髓DNA含量的影響。從表中可知，荷瘤裸鼠經3次鈷源照射后，骨髓DNA含量顯著低于空白對照組（P＜0.01），而STCP可顯著升高放療動物骨髓有核細胞DNA的含量（P＜0.01）。

表2 STCP對動物骨髓DNA含量的影響（±s,n=20）

表2 STCP對動物骨髓DNA含量的影響（±s,n=20）

注：與鈷源照射組比較，ΔΔP＜0.01；與空白對照組比較，**P＜0.01。

組 別 劑量 骨髓DNA含量/μg·mL-1空白對照組 -- 33.58±10.85鈷源照射組 3.5Gy/周 16.23±2.67**STCP高劑量組 20.8g/kg 33.92±8.48**△△STCP中劑量組 10.4g/kg 37.15±6.99**△△STCP低劑量組 5.2g/kg 34.50±7.82**

表3 STCP對鈷源照射治療荷瘤裸鼠總體生存率的影響（±s,n=20）

表3 STCP對鈷源照射治療荷瘤裸鼠總體生存率的影響（±s,n=20）

注：與鈷源照射組比較，ΔΔP＜0.01；與空白對照組比較，**P＜0.01。

組別 劑量空白對照組 --100.0鈷源照射組 2.0Gy 0.0 STCP高劑量組 20.8g/kg 20.0 STCP中劑量組 10.4g/kg 25.0 STCP低劑量組 5.2g/kg 15.0平均存活時間/d 存活數/只60.00±0.00 20 33.50±2.78**0 41.25±12.41**△△4△△41.45±12.41**△△5△△44.70±10.12**△△3△△存活率/%

3.5 STCP和60Co聯合治療對荷瘤動物總體生存率的影響 為進一步了解STCP的放療保護作用，本研究考察了STCP對放療動物總體存活率的影響，結果見表3。從表中可知，經大劑量鈷源照射之后，模型組動物全部死亡，而高、中、低劑量STCP組的動物存活數分別為4、5、3只。另外，STCP均可顯著延長放療后荷瘤小鼠的平均存活天數（P＜0.01）。提示：STCP可顯著提高化療動物的總體生存率。

4 結論

甲魚是傳統的中藥材[2-3]，也是中國民間傳統的藥食配伍組分之一，含有豐富的蛋白質、脂肪、碳水化合物、動物膠及鈣、鐵、維生素B族等營養成分[4]，具有滋陰清熱、平肝熄風、軟堅散結等功效。現代藥理研究表明，甲魚提取物具有抗衰老[5]、抗突變[6]、增強機體免疫能力[5,7]，以及抗腫瘤[7-9]等功效。甲魚復合肽采用甲魚、海洋魚皮膠原低聚肽、大豆低聚肽及酪蛋白磷酸肽為原料，同時均衡搭配水溶性膳食纖維、枸杞子、葡萄糖酸鋅等營養素制成的一種特殊營養膳食，一方面保留了甲魚的生物活性，同時提高了甲魚及其他成分的營養吸收效率。

本研究表明，甲魚復合肽與60Co聯合治療后，對移植于裸鼠皮下的人胃癌的生長無明顯影響，但甲魚復合肽可顯著降低鈷源照射治療對荷瘤動物所產生的骨髓損害，其骨髓DNA含量均顯著升高，外周血白細胞數也有一定升高，同時甲魚復合肽還可明顯延長放療后荷瘤動物的存活時間并降低死亡率，提示甲魚復合肽對放療動物具有明顯的骨髓保護作用。

［1］國家食品藥品監督管理局.保健食品功能學評價程序和檢驗方法規范[M].北京:國家食品藥品監督管理局許可司,2011：124-132.

［2］方達任，張克蘭.龜板鱉甲的化學成分研究[J].中成藥，1989,11（2）:31-32.

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Ad juvant Effects of Snapping Turtle Co-Peptide（STCP）on Radiotherapy for Cancer

FU Jian-jiang1,TAN Song-lin1,LIYi-guang2,LV Hong1,ZHUW ei-feng1,LIU Hong-ning1
1.JiangxiUniversity of TCM,Nanchang 330004,China;
2.Jiangzhong Pharmaceutical Co.Ltd,Nanchang 330096,China.

Objective:To evaluate the adjuvant effects of Snapping Turtle Co-Peptide （STCP）on radiotherapy for cancer.Methods: BGC-823 xenograftmodel of nudemice was established,and tumor growth curve,tumor weight,and overall survival of nude mice weremonitored.In addition,white blood cells and DNA content of bonemarrow were detected.Results:No significant synergistic effects were observed on tumor volume and weight（P＞0.05）.But compared to60Co treated group,body weight and DNA content in bonemarrow were obviously up-regulated （P＜0.01）after co-treated with STCP and60Co In addition,there were an significant increase in STCP and60Co co-treated groups（P＜0.05）.Conclusion:STCP cannot enhance antitumor properties of radiotherapy in gastric cancer,but this food for special dietary usesmay attenuate side effects of radio-therapeutic agents.

Snapping Turtle Co-Peptide;Radiotherapy;Attenuation and synergy;60Co

R285.5

A

2014-03-27）編輯：萬崇毅

國家自然科學基金項目（30860375，81160530，81260656）；教育部科學技術研究重點項目（211091）；江西省自然科學基金項目（2010G QY0147）；贛鄱英才555工程人才項目。

**第一作者：付劍江，博士，副教授。研究方向：中藥抗腫瘤藥理。T el:（0791）87118919，E-m a il:j i a n j i a n g_f u@ye a h.net。

***通信作者：劉紅寧，博士，教授，博士生導師。研究方向：中藥新藥開發與新劑型。