紫外分光光度法測定不同產(chǎn)地黃芪總黃酮的含量*

★ 程研閔會何厚洪胡江寧吳健王小東王如偉（1.浙江中醫(yī)藥大學 杭州1005；.浙江康恩貝藥品研究開發(fā)有限公司 杭州 1005；.大興安嶺地區(qū)食品藥品檢驗檢測所 黑龍江鶴崗 165000；4.浙江康恩貝制藥股份有限公司（浙江省中藥制藥技術(shù)重點實驗室） 杭州 1005）

紫外分光光度法測定不同產(chǎn)地黃芪總黃酮的含量*

★ 程研1**閔會2何厚洪2胡江寧2吳健2王小東3王如偉1,4***（1.浙江中醫(yī)藥大學 杭州310053；2.浙江康恩貝藥品研究開發(fā)有限公司 杭州 310052；3.大興安嶺地區(qū)食品藥品檢驗檢測所 黑龍江鶴崗 165000；4.浙江康恩貝制藥股份有限公司（浙江省中藥制藥技術(shù)重點實驗室） 杭州 310052）

目的：建立黃芪中總黃酮的含量測定方法，比較不同產(chǎn)地黃芪藥材總黃酮的含量。方法：以毛蕊異黃酮苷為對照品，采用紫外分光光度法，測定波長為260 nm，對不同產(chǎn)地黃芪藥材總黃酮的含量進行測定。結(jié)果：毛蕊異黃酮苷在4～20μg/m L呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，r=0.9999，平均回收率為99.96%，RSD%為1.53%；不同產(chǎn)地黃芪藥材，總黃酮含量在0.234%～0.383%范圍內(nèi)。結(jié)論：本實驗建立的方法適用于測定黃芪藥材中總黃酮的含量；不同產(chǎn)地黃芪中總黃酮含量以毛蕊異黃酮苷計由高到低依次為大興安嶺、甘肅、山西、內(nèi)蒙古。

紫外分光光度法；毛蕊異黃酮苷；總黃酮；含量測定

黃芪為豆科植物蒙古黃芪AstragaLus membranaceus（F isch.）B g e.v a r.m on g ho L icus（B g e.）H si a o或陽、利水消腫之功效[5]?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃酮類成分為黃芪抗腫瘤的有效成分之一[6]，王光忠[7]、陳鑫[8]、李春紅[9]等分別以蘆丁為對照，對黃芪中總黃酮的含量進行了測定。郭帥等[10]在研究黃酮純化工藝時則以毛蕊異黃酮苷為對照，對總黃酮進行測定。但通過楊范莉[11]、馮祖飛[12]、梁瑾[13]等對黃芪藥材中黃酮類成分的研究表明，其黃酮類成分中以毛蕊異黃酮苷的含量最高。因此作者選擇以毛蕊異黃酮苷為對照，對黃芪藥材中總黃酮含量測定方法進行系統(tǒng)研究，測定結(jié)果真實、可靠，可以為黃芪藥材中黃酮類成分深入研究提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UV-2450型紫外分光光度計（日本島津）；AgiLent1200高效液相色譜儀（AgiLent公司）；BS210S電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；AX 205電子天平（瑞士梅特勒?托利多公司）；HWS26型恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）。

1.2 材料與試藥 山西、內(nèi)蒙古、甘肅及大興安嶺黃芪藥材（購自磐安康恩貝藥材發(fā)展有限公司）；毛蕊異黃酮苷（純度≥99%，批號：130312，上海盛中醫(yī)藥化工有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備 取毛蕊異黃酮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1m L含0.5052m g的溶液，即得。

2.2 供試品溶液的制備 分別取樣品粉末（過四號篩）約0.5 g，精密稱定，置茄形瓶中，精密加入70%乙醇50m L，加熱回流3 h，濾過，濾液合并，濃縮至近干。加10m L水使溶解，轉(zhuǎn)移至60m L分液漏斗中，加水飽和正丁醇振搖提取3次，每次25m L，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10m L量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得各樣品的供試品溶液。

2.3 測定波長的選擇 精密量取對照品溶液和供試品溶液1.0m L，分別置25m L量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，在900～190 n m波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果對照品溶液和供試品溶均在260 n m處有特征吸收峰。

2.4 測定法 精密量取供試品溶液1.0m L，置25m L量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，照紫外-可見分光光度法，在260 nm的波長處測定吸光度。

2.5 標準曲線的制備 精密量取對照品溶液0.2, 0.4，0.6，0.8，1.0m L，分別置25m L量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，以相應試劑為空白，照紫外-可見分光膜莢黃芪AstragaLusmembranaceus（F isch.）B g e.的干燥根[1]，主要含有黃酮、皂苷、多糖等[2-4]，具有補氣升光度法，在260 nm的波長處測定吸光度，以吸光度（X）為縱坐標，濃度（Y）為橫坐標，繪制標準曲線。得回歸方程為Y=55.897X-0.0007,r=0.9999，說明毛蕊異黃酮苷在4～20μg/m L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.6 方法學驗證

2.6.1 精密度試驗 精密量取“2.2”項下供試品溶液1份，稀釋25倍，于260 nm波長處平行測定吸光度6次，RSD為0.57%，精密度良好。

2.6.2 穩(wěn)定性試驗 精密量取“2.2”項下供試品溶液，稀釋25倍，分別在0，1，2，4，6，24 h測定吸光度，RSD為4.95%，樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.3 重復性試驗 取6份黃芪粗粉，精密稱定，參照“2.2”項下供試品溶液制備方法制備供試品，參照“2.4”項下測定法測定并計算總黃酮含量，結(jié)果RSD為1.41%，符合要求。

2.6.4 回收率試驗 取黃芪粗粉約0.25 g共6份，精密稱定，分別精密加入1m L毛蕊異黃酮苷對照品溶液（0.776mg/m L），精密加入70%乙醇50m L，搖勻，參照“2.2”項下供試品溶液制備方法制備供試品，參照“2.4”項下測定法測定并計算總黃酮含量，結(jié)果加樣回收率為97.39%～101.50%，平均為99.96%，RSD為1.53%。

表1 不同產(chǎn)地黃芪藥材中總黃酮含量（n=10）

2.7 樣品的含量測定 參照“2.2”項下供試品溶液制備方法制備供試品，參照“2.4”項下測定法測定總黃酮含量，計算不同產(chǎn)地黃芪藥材中總黃酮含量（表1）。

以毛蕊異黃酮苷計，不同產(chǎn)地黃芪藥材中總黃酮的含量大小依次為大興安嶺＞甘肅＞山西＞內(nèi)蒙。其中，大興安嶺地區(qū)黃芪藥材中總黃酮含量普遍較高。但總體上看，各地黃芪藥材中總黃酮含量相差不大。

3 討論

3.1 對照品的選擇 國內(nèi)多以蘆丁為對照品，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法測定黃芪藥材中總黃酮的含量[14-16]。作者參照《中國藥典》中蘆丁的含量測定方法，利用HPLC法測定黃芪藥材中蘆丁和毛蕊異黃酮苷的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在供試品溶液的色譜圖中未檢測出明顯的蘆丁色譜峰，并且，通過計算得出藥材中毛蕊異黃酮苷的含量為0.07%，約占總黃酮的20%，是黃芪藥材中最主要的異黃酮類成分。汪德清等報道黃芪總黃酮中，異黃酮類化合物占74%[17]?！吨袊幍洹伏S芪項下亦確定毛蕊異黃酮苷作為藥材質(zhì)量的評價指標，因此作者選擇以毛蕊異黃酮苷作對照，建立黃芪藥材中總黃酮含量的測定方法。

3.2 供試品溶液制備的前處理過程篩選 南換杰[18]通過石油醚脫脂-乙醇提取，測定黃芪中總黃酮的含量。朱正蘭[15]在石油醚脫脂-乙醇提取的基礎(chǔ)上，增加了乙酸乙酯萃取的步驟，操作過程較為繁瑣。作者試驗過直接采用乙醇提取，以毛蕊異黃酮苷為對照品來測定黃芪中總黃酮的含量，但全波長掃描結(jié)果中未檢測出最大吸收波長。參考朱正蘭的樣品前處理方法，采用70%乙醇提取、乙酸乙酯萃取的方法來制備供試品溶液，節(jié)省了樣品前處理時間。之后，作者測定了轉(zhuǎn)移后的溶液分別經(jīng)乙酸乙酯萃取和水飽和正丁醇萃取后的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)供試品溶液經(jīng)水飽和正丁醇萃取后測得含量更高，通過H P L C法檢測發(fā)現(xiàn)供試品溶液經(jīng)水飽和正丁醇萃取后在254 n m下有紫外吸收的物質(zhì)并未減少，而E L SD檢測器檢測到黃芪中部分物質(zhì)被除去，因此我們確定了70%乙醇提取、水飽和正丁醇萃取測定黃芪中總黃酮含量的測定方法，可用于快速測定黃芪中總黃酮的含量。

3.3 不同產(chǎn)地黃芪藥材中總黃酮的含量測定 由測定結(jié)果可以看出，大興安嶺產(chǎn)黃芪藥材中總黃酮含量相對最高，且不同批次間相對穩(wěn)定（含量為0.354%～0.383%），甘肅、山西產(chǎn)黃芪中總黃酮含量次之，內(nèi)蒙古產(chǎn)黃芪藥材中總黃酮含量最低。但總體來看，四個產(chǎn)地黃芪藥材中總黃酮的含量差別不大。

上述試驗建立的以毛蕊異黃酮苷為對照品，測定不同產(chǎn)地黃芪藥材中總黃酮含量的方法操作簡單、精密度高、結(jié)果準確可靠，可用于黃芪藥材中總黃酮的含量測定和黃芪藥材的質(zhì)量控制。

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Determ ination of Flavonoid in AstragaLus Grown in Different Areas by UV Spectrophotometry

CHENG Yan1,M IN Hui2,HE Hou-hong2,HU Jiang-ning2,WU Jian2,WANG Xiao-dong3,WANG Ru-wei1,4
1.Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310053,China；
2.Zhejiang Conba Drug Research and Development CO.,LTD.,Hangzhou 310052,China；
3.Daxing'anling Food and Drug Inspection Institute,Hegang 165000,China；
4.Zhejiang Conba Pharmaceutiacl CO.LTD.（Zhejiang Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Pharmaceutical Technology）,Hangzhou 310052,China.

Objective:To establish a new method for determining the contents of flavonoid in AstragaLus among different areas.Methods:Flavonoid in AstragaLuswas determined by UV spectrophotometry at the wavelength 260 nm,with calycosin-7-glucoside as index.And thismethod can be used for assaying of flavonoid in AstragaLus from different habitats.Results:The linear range of calibration curve was 4～20μg/mL,r=0.9999.The average recovery rate was 99.96%with the relative standard deviation 1.53%.The contents of flavonoid in AstragaLus were 0.234%～0.383%.Conclusion:Thismethod can be used for evaluation of quality of flavonoid in AstragaLus.The contents in flavonoid can be ranked as follows:Daxinganling>Gansu>Shanxi>Neimenggu.

UV Spectrophotometry;calycosin-7-glucoside;flavonoid;quantitativ-e determination

R284.1

A

2014-09-29）編輯：曾文雪

浙江省企業(yè)研究院項目（2010E90011）。

**第一作者：程研（1990-），女，碩士。研究方向：中藥質(zhì)量標準與質(zhì)量控制。E-mail：18958046151@163.com。

***通信作者：王如偉，男，博士生導師。Tel:（0571）87774766，E-mai:wangrw@conbagroup.com。