近紅外光譜法測定銀黃混合液終點黃芩苷和綠原酸含量*

★ 陳艷劉順國肖雪劉明穎高建勝龍曉英（.廣東藥學院 廣州50006；.廣州白云山明興制藥有限公司 廣州5050；3.中山大學南沙研究院 廣州5458）

近紅外光譜法測定銀黃混合液終點黃芩苷和綠原酸含量*

★ 陳艷1**劉順國2肖雪1,3***劉明穎2高建勝2龍曉英1（1.廣東藥學院 廣州510006；2.廣州白云山明興制藥有限公司 廣州510250；3.中山大學南沙研究院 廣州511458）

目的：建立銀黃混合液終點的近紅外光譜（near infrared spectroscopy，NIR）校正模型，探討NIR快速測定黃芩苷和綠原酸含量的方法。方法：采用多種光譜預處理方法、波長選擇方法結合偏最小二乘法對銀黃混合液的光譜圖與黃芩苷、綠原酸的含量進行關聯擬合，并通過交互檢驗標準偏差（SECV）、校正標準偏差（SEC）和決定系數（R2）及優選校正模型。結果：建立的黃芩苷、綠原酸的NIR校正模型的預測能力較好。結論：NIR技術可以用于銀黃混合液終點階段的黃芩苷、綠原酸含量。

清開靈注射液；銀黃混合液；近紅外光譜；在線檢測

清開靈注射液是由黃芩苷、金銀花等藥材經過現代生產工藝制備而成，主要功效為清熱解毒、鎮靜安神，在臨床上有著廣泛的應用[1]。但是清開靈注射液生產工藝復雜，步驟繁多，尤其是液體配制環節眾多，對清開靈注射液的產品質量有著重要的影響[2-4]。清開靈注射液生產過程中有一關鍵的混合配制工藝即金銀花提取液和黃芩苷的混合，混合配制的結果直接影響到后續的生產工藝。該過程目前尚沒有良好的檢測手段進行實時檢測，均需要等到混合配制完畢后取樣進行常規理化分析，費時費力、結果滯后，不利于生產的快速放行，不適合中藥現代化生產的需要。近紅外光譜技術（near infrared spectroscopy，NIRS）是近些年來發展較快的一種過程分析技術，其具有分析快速、多指標成分同時測定、樣品基本不需要前處理等多種優點[5-8]。本研究擬采用NIRS技術對銀黃混合配制過程的終點進行在線監控研究，提高生產效率。

1 儀器與材料

1.1 實驗儀器 Antaris II型傅立葉變換近紅外光譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司，配鹵鎢燈，InGaAs檢測器）；清華大學化學計量學分析系統THUNIR V3.0；W aters2695高效液相色譜儀（美國W aters科技有限公司）；CPA-224S型電子天平（德國Sartorius集團）；Synergy UV水純化系統（美國Merck M illipore公司）。

1.2 試劑與樣品 黃芩苷對照品（批號110715-2011 17）、綠原酸對照品（批號110753-200413）均采購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈均為色譜純（Merck公司）；甲酸、磷酸均為分析純（北京現代東方精細化工有限公司）；超純水自制；其余試劑均為分析純。銀黃混合配制液樣品（廣州白云山明興制藥有限公司）。

2 實驗方法

2.1 指標成分的測定 參照2010年版《中國藥典》規定的方法和清開靈注射液質量標準（2012年版）對銀黃混合液中有效成分進行含量測定。

2.2 銀黃混合液的制備及取樣 在銀黃混合罐內預先放入黃芩苷粉末，逐漸流加金銀花提取液并同時攪拌，自流加完畢，混合數分鐘后，開始混合過程的取樣。在銀黃混合罐罐體設置一個取樣窗口，實時采集混合配制過程中的銀黃混合液樣品。

2.3 近紅外光譜掃描 采用近紅外光譜透射探頭插入銀黃混合罐內，探頭置于液面1/3下。采集不同批次的透射光譜圖，光譜掃描范圍10 000～4 000 cm-1，掃描次數32次，分辨率為8 cm-1，液體樣品池為2mm光程的石英比色皿，實驗采用空氣為參比進行光譜掃描，測量時溫度為25℃，濕度為50%。

2.4 數據處理[9-12]將樣品分為校正集、檢驗集及外部預測集。

采用多種預處理方法如無預處理、卷積平滑、卷積求導、多元散色校正、標準正態變量變換和歸一化中的一種或幾種對光譜進行優化。采用多種波長選擇方法如全波長法、相關系數法、迭代優化等對光譜進行波長選擇。采用偏最小二乘法對樣品的光譜數據與其性質含量值做回歸擬合計算，建立校正模型。

2.5 模型評價參數 采用交互驗證標準偏差（standard error of crossvalidation，SECV）、校正標準偏差（standard error of calibration，SEC）、主因子數（numbersof latent variable，LV）、決定系數（coefficient of determ ination，R2）等作為模型的評價參數。通過SECV和SEC優選出每種不同波長選擇方法下的模型，然后以LV和R2做比較優選最佳模型。

3 結果與應用

3.1 銀黃混合液中主要指標成分的含量測定結果按照“2.1”項下的方法測定銀黃混合液樣品中的主要指標成分黃芩苷、綠原酸的含量，結果如表1所示。

3.2 校正模型的建立與選擇

3.2.1 樣品光譜圖的采集與預處理 按照“2.3”項的方法對“2.2”項中采集的銀黃混合液進行光譜采集，如圖1A所示。

表1 銀黃混合液中黃芩苷、綠原酸含量 mg·mL-1

圖1 銀黃混合液近紅外光譜圖

表2 黃芩苷校正模型的優選

表3 綠原酸校正模型的優選

圖2 黃芩苷校正模型參數圖

3.2.2 校正模型的建立 按照“2.4”項下的預處理方法對“3.2.1”項下采集到樣品光譜圖進行預處理，如圖1B-I所示。

按照“2.4”項下的波長選擇方法對“3.2.1”項下經預處理后的光譜圖與“3.1”項下測定的黃芩苷、綠原酸含量通過PLS進行擬合回歸，建立多個校正模型，結果如表2和表3所示。

3.2.3 校正模型的主要參數 通過表2和表3，對比各個模型的具體參數，如LV、SEC、SECV等，最終選擇的校正模型為：（1）黃芩苷，光譜范圍為5804.685~ 6402.509 cm-1，光譜預處理方法為歸一化，主因子數為4，得到SEC為0.6945，SECV為0.9950，R2為0.9985；（2）綠原酸，光譜范圍為5793.114~6387.082 cm-1和7586.588~8180.556 cm-1，光譜預處理方法為卷積平滑，主因子數為4，得到SEC為0.0014，SECV為0.0019，R2為0.9997。

圖2和圖3分別為黃芩苷和綠原酸校正模型的參數圖。從圖可以看出，黃芩苷和綠原酸的校正模型均較好，可用于檢驗集的數據預測。

3.2.4 校正模型的檢驗 將“3.2.3”項下選擇好的校正模型，預測驗證集中的8個樣品，其結果如表4所示。從表4可以看出，銀黃混合液中的黃

圖3 綠原酸校正模型參數圖

表4 銀黃混合液驗證集結果分析 mg·mL－1

圖4 銀黃混合液校正模型的在線檢驗（A.黃芩苷；B.綠原酸）

芩苷和綠原酸含量預測均較準確，偏差較小，均在可接受的誤差范圍內。該模型可以用于實際生產過程中銀黃混合液的在線檢測。

3.3 校正模型的應用 將經過檢驗的銀黃混合液的校正模型，導入清開靈注射液生產在線監控系統，在線檢測銀黃混合液中的黃芩苷和綠原酸的含量，如圖4所示。

4 討論

銀黃混合配制階段是清開靈注射液生產過程中的關鍵配制工藝點，其混合效果的結果直接影響了后續工段的順利開展。本試驗采用了近紅外光譜技術對銀黃配混階段混合終點的主要成分黃芩苷、綠原酸進行了快速的含量測定，預測結果與標準方法測定結果基本一致。在線近紅外光譜技術可以推廣應用于中藥注射液的生產過程，給其生產帶來巨大的便利，有效的控制生產過程中的質量參數。

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［3］史留喜，肖玉春，李莎莎，等.清開靈注射液不良反應及對策分析[J].江西中醫藥，2011，42（11）：30-32.

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Rapid Determ ination of Baicalin and Chlorogenic Acid of Ying-huang M ixture by Near Infrared Spectroscopy

CHEN Yan1,LIU Shun-guo2,XIAO Xue1,3,LIU M ing-ying2,GAO Jian-sheng2,LONG Xiao-ying1
1.Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510006,China;
2.Guangzhou Baiyunshan Mingxing Pharmaceutical Co.Ltd.,Guangzhou 510250,China;
3.Nansha Research Institute,Sun Yat-sen University Guangzhou 511458,China.

Objective:To establish amixed calibration model to determine the concentrations of Baicalin and Chlorogenic acid of Yin-Huangmixture during the Yinhuangmixing process by near infrared spectroscopy（NIR）.Methods:A variety of spectroscopy pretreatmentmethods and several wavelength selection methods combined the concentrations of Baicalin and Chlorogenic acid of Yinhuang mixture were used to build the calibration models by partial least squares regression,and the standard error of cross validation,the standard error of calibration and the coefficient of determination were used to evaluate themodels.Results:The predictive ability of the models was good as referencemethod.Conclusion:NIR can be used to rapidly determine the concentrations of Baicalin and Chlorogenic acid of Yin-Huangmixture during the Yin-Huangmixing process.

Qingkailing Injection;Yin-Huang Mixture;Near Infrared Spectroscopy;Online

R284.1

A

2014-08-04）編輯：曾文雪

“重大新藥創制”科技重大專項（2011ZX 09201-201）。

**第一作者：陳艷（1989-），女。研究方向：中藥制劑與開發。E-mail：994605413@qq.com。

***通信作者：肖雪，博士。研究方向：中藥質量分析與生產過程智能控制。E-mail：erxiaohappy@163.com。