海洋酸化對海水青鳉胚胎骨骼發育的影響

王曉杰，肖瀟，李超，岳娜

（1.上海海洋大學海洋生物系統和神經科學研究所，上海 201306；2.上海海洋大學國際海洋研究中心，上海 201306；3.上海海洋大學省部共建水產種質資源發掘與利用教育部重點實驗室，上海 201306）

海洋酸化對海水青鳉胚胎骨骼發育的影響

王曉杰1，2，3，肖瀟1，李超1，岳娜1

（1.上海海洋大學海洋生物系統和神經科學研究所，上海 201306；2.上海海洋大學國際海洋研究中心，上海 201306；3.上海海洋大學省部共建水產種質資源發掘與利用教育部重點實驗室，上海 201306）

本文在實驗室模擬近期海洋酸化水平，對海洋酸化對海水青鳉魚（Oryziamelastigma）胚胎骨骼發育的影響進行了初步研究。實驗中，通過往實驗水體中充入一定濃度CO2氣體酸化海水。對照組CO2分壓為450×10－6，兩個處理組CO2濃度分別為1 160×10－6和1 783×10－6，對應的水體p H值分別為8.14，7.85和7.67。將海水青鳉魚受精卵放入實驗水體中至仔魚孵化出膜，對初孵仔魚經骨骼染色、顯微拍照，挑取了仔魚頭部、軀干及尾部骨骼染色清晰的28個骨骼參數的長度進行了顯微軟件測量及數據統計分析。結果發現，酸化處理對實驗魚所測量的骨骼長度影響均不顯著。因此推測，未來100～200年間海洋酸化對海水青鳉魚的胚胎及初孵仔魚的骨骼發育沒有顯著影響。

青鳉魚；海洋酸化；骨骼發育

1 引言

自工業革命以來，大約1 420億噸由人類活動產生的CO2被海洋吸收，導致海洋快速酸化。如果繼續按照目前這種化石燃料消耗量和大氣CO2濃度升高的趨勢發展（目前濃度是390×10－6），到21世紀末CO2濃度會增加至720×10－6～1 020×10－6［1］，p H值可能會下降0.3～0.4［2］，而海水氫離子濃度會比工業革命以前上升100%～150%。

海洋酸化對海洋生物的影響，主要體現在對具有外骨骼或者內骨骼的海洋生物鈣化過程的影響［3］。然而，對于海洋酸化對魚類等其他非鈣化生物影響的研究較少。在硬骨魚中，在早期生活史階段由于體內缺乏成熟的p H調節機制，對海洋酸化較為敏感。例如，較高濃度CO2（約2 000×10－6）的酸化處理，會引起魚類早期發育的遲緩［4］、降低RNA／DNA比［5］以及身體內部多組織損傷［6］等。

魚類體內的鈣化器官，主要是內耳耳石，體內骨骼中也含有少量碳酸鈣。已有研究發現，海洋酸化使海水魚仔魚的耳石體積、表面積和密度等顯著增加［7］，其影響機制可能與酸化情況下，HCO－3濃度上升導致耳石周圍的內淋巴液中文石飽和度增加有關［8］。骨骼是魚體質量的重要組成部分，頭部和脊椎骨骼大約占魚體總質量的10%～15%［9］。骨骼的主要成分是礦物質如鈣、磷和膠原蛋白［10］。骨骼礦物質是一種磷灰石，主要是一類鈣羥基磷灰石，并含有少量和痕量的其他成分，如碳（C）、鎂（Mg）和鈉（Na）。生物體內CO2－3對PO3－4離子的替換，能夠導致磷灰石微晶大小變小和溶解度的增高［11］。而且生物微環境變化、血液中p H值以及HCO－3或者CO2－3都可導致生物體內幾種磷灰石形式的轉變［12－13］。目前，海洋酸化對仔稚魚骨骼發育影響的研究極少，并且研究結果也不一致。Munday等研究發現，經600～850 μatm的不同酸化處理后，多棘雀鯛（Acanthochromis polyacanthus）稚魚的骨骼參數的變化與酸化處理之間沒有必然相關性［14］。但是，在對塞內加爾鰨（Solea senegalensis）進行升溫和酸化的綜合處理后，造成了31.5%的畸形率，畸形主要發生在頭骨、脊柱、鰭等部位［15］。有限的研究不能全面了解酸化對魚類骨骼發育的影響，因此有必要開展進一步的研究。

海水青鳉（Oryziamelastigma）具有個體小、世代時間短、兩性特征明顯、每日均可產卵、卵透明等優點，作為一種模式物種已廣泛應用于海洋生態毒理學研究［16］。而且，淡水青鳉（Oryziaslatipes）已經完成了全基因組測序［17］。因此，本文將海水青鳉作為研究對象，研究海洋酸化對其骨骼發育的影響，為全面、深入了解酸化對魚類影響形式及機制奠定基礎。

2 材料與方法

2.1 實驗魚

海水青鳉成魚每天投喂3次初孵鹵蟲，養殖水溫23～28℃，每天吸底換水。受精卵經新鮮海水沖洗干凈用于實驗。

2.2 實驗設置與水化學

經非色散式CO2測試計（TES-1370，臺灣泰仕）測定實驗室內CO2濃度為450×10－6，作為對照組。設兩個處理組，CO2濃度分別為1 200×10－6和1 800 ×10－6，取約300粒受精6 h之內的受精卵放入5 L的三角錐形瓶中，每個處理組設3個平行，每組水溫為28℃。

實驗用水是由曝氣自來水加入紅海鹽配制而成。對照組利用氣泵直接通入空氣，利用CO2加富器（CE 100，武漢瑞華）控制CO2濃度。利用p H計（SevenE-asy，METTLER TOLEDO）測量實驗水p H值。鹽度采用鹽度折射計測量。海水總堿度采用滴定法測定。水中碳酸系統的其他參數利用CO2SYS軟件進行計算［18］。

2.3 骨骼參數測量

每天檢查瓶內是否有初孵仔魚，當發現初孵仔魚之后，放入－30℃冰箱中保存。

在實驗結束后，在每個平行組取10尾魚，每個處理共30尾魚，進行骨骼的染色以及骨骼參數的測量。對初孵仔魚，先后采用阿利新蘭軟骨染色方法和茜素紅硬骨染色方法。在體視顯微鏡下拍照（Stereo Discovery.V12，ZEISS），并利用顯微鏡自帶軟件（Axio-Vision Rel.4.7）對骨骼參數進行測量。由于初孵仔魚骨骼鈣化程度低，茜素紅染色不明顯，阿利新蘭染色較清晰，因此，根據軟骨染色著色情況進行骨骼參數測量。頭骨骨骼著色較深，分別對頭部側面、腹面和背面的骨骼進行測量。脊椎骨著色相對較淺，但椎骨間長度差異不顯著，因此，每尾魚選取4個椎骨進行了測量，取其平均值。選取測量骨骼參數的條件：（1）在大部分的樣品中均清晰可見；（2）測量時有明顯可辨別的起止點。測量的骨骼參數詳見圖1中海水青鳉魚骨骼染色照片。

2.4 數據統計

所有數值采用平均值±標準差表示，用單因素方法分析（one-way ANOVA）和Duncan多重比較對組間數據進行差異顯著性分析，以P＜0.05為差異顯著標準。統計分析使用SPSS 11.5軟件進行。

3 結果

3.1 實驗水體碳酸鹽系統各參數測定結果

實驗水體中碳酸鹽系統的各參數見表1。

表1 實驗水體中各實驗組碳酸鹽系統參數值Tab.1 Summary of seawater carbonate system parameters in the cultures

3.2 海水酸化對青鳉魚骨骼參數的影響

在對所有初孵仔魚進行觀察后，在兩個實驗組中沒有發現其他明顯可辨別的畸形。初孵仔魚骨骼染色圖及主要骨骼示意圖見圖1，測量的各個骨骼參數起止點示意圖見圖2。

圖1 海水青鳉初孵仔魚骨骼染色及解剖示意圖Fig.1 The staining and anatomical schematic pictures of bones in marine medaka larvae

對照組中各個骨骼參數數值及3個實驗組間骨骼參數的差異顯著性分析結果，如表2所示。對實驗魚28個骨骼參數進行了測量，經統計分析后，酸化處理對實驗魚所測量的骨骼長度影響均不顯著。而且，經過酸化處理后，所測定的28個骨骼長度并不呈現一致的變化趨勢，而是呈隨機變化，與酸化處理水平之間沒有相關性。

圖2 實驗中測量的各骨骼參數的起止點示意圖Fig.2 The schematic pictures of measured skeleton parameters which start and ending points were shown

表2 各組中骨骼參數平均長度以及這些參數的組間差異Tab.2 The average of lengths of parameters of skeletons in three groups and their differences among groups

續表2

4 討論

目前空氣中CO2平均濃度已超過380×10－6，若以每年0.5%的速度增加，推測至本世紀末將CO2濃度將至1 000×10－6，至2300年將至1 900× 10－6［1，19—20］。本文的研究提示，未來100～200年間海洋酸化對海水青鳉的胚胎及初孵仔魚的骨骼發育沒有明顯的影響。

魚類的骨骼主要是由磷酸鈣和軟骨質物質組成［21］，而非碳酸鈣，所以海洋酸化對骨骼的直接影響較少，但是酸化情況下伴隨魚體內碳酸氫鹽和非碳酸氫鹽的緩沖調節系統的改變，可能間接的影響骨骼發育。骨骼的主要成分磷灰石有多種存在形式，在生物體內各種磷灰石的形成，受p H、溫度和組成成分的影響，而且在HCO－3或者CO2－3存在的p H呈中性或堿性時，也會促使不同溶解度的磷灰石成分之間的轉換［12］。體外實驗也證明，骨骼礦化過程中，從非結晶磷酸鈣到羥化磷灰石的轉變會受到CO2－3濃度的影響［22］。在本文的實驗條件下，未來100～200年間海水酸化水平，對青鳉魚的胚胎及初孵仔魚的骨骼發育沒有明顯的影響。同樣，在CO2分壓為850μatm情況下，多棘雀鯛仔稚魚29個骨骼參數與對照組相比，也沒有顯著差別［14］。魚類由于生活于水中，與陸生動物相比，需要呼出更多CO2以獲得足夠的氧氣，因此正常情況下其體內HCO－3濃度較低。處于酸化水體中的魚類，體內HCO－3濃度會相應升高，但由于魚類成體具備較好的酸堿調節機制，通過鰓表面、腎、腸等組織，能夠排出體內過多的HCO－3和H＋［23］。然而，在仔稚魚階段，其體內的組織器官發育不成熟，對酸化處理較敏感。但是本研究中海洋酸化沒有明顯影響海水青鳉魚胚胎期骨骼發育。推測主要原因是海水青鳉原產于CO2自然變化范圍較大的沿海，使其對實驗中CO2變化耐受力較高。海水青鳉原產于印度和孟加拉國沿海［24］，沿海地區是具有重要生態價值和經濟價值的海洋生物的主要棲息地，同時由于生物量的季節變化、河流沖淡水、上升流和沿岸人類活動影響等原因，造成水體中CO2濃度自然變化較大，變化幅度遠遠超過外海的CO2自然變化［25］。

全球氣候變化效應的研究中，溫度與CO2是緊密相聯的。在海洋生態系統中，溫度升高、缺氧與酸化等環境脅迫因子可能同時存在，它們之間共同作用對海洋生物的影響可能比單一海洋酸化的影響更為嚴重［26—27］。Pimental等報道，升溫和酸化綜合處理塞內加爾鰨（S.senegalensis）稚魚，嚴重影響其骨骼發育［15］。目前，海洋酸化引起魚體碳酸鹽體系的變化對于骨骼發育、磷酸鈣形成的影響機制還未見報道。淡水青鳉魚已經完成基因組測序，海水青鳉魚與其親緣關系較近，因此，在將來的研究中，可以利用分子生物學技術，深入研究海洋酸化與其他環境因子協同作用下，海水青鳉魚體內碳酸鹽系統和磷酸鹽系統之間的生理調節機制。

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Impact of ocean acidification on skeletal development in embryonic marine medaka

Wang Xiaojie1，2，3，Xiao Xiao1，Li Chao1，Yue Na1

（1.Institute for Marine Biosystem and Neurosciences，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；2.International Center of Marine Study，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；3.Key Laboratory of Exploration and Utilization of A-quatic Genetic Resources，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

In this study，the impact of ocean acidification on the skeletal development in embryonic marine medaka was investigated.The seawater carbonate system in the water was maintained stable by aerating with ambient air（450×10－6CO2）and CO2-enriched air（1 160×10－6or 1 783×10－6CO2）.Newly fertilized medaka eggs were exposed to three levels ofpCO2／p H（8.14，7.85 and 7.67）until to the main hatch occurring.Skeletons of 30 newhatched larvae from each CO2treatment were cleared，stained and photographed.Lengths of well stained 28 skeletal elements for ecah fish was measured using digital photograph and analyzed by image analysis software.Results showed that，the effects of exposure to elevated CO2concentrations on the length of representative skeletal elements were not significant.It suggested that the skeletal development of marine medaka would not be seriously affected by the changes in CO2concentrations that are predicted to occur over the next 100 to 200 years.

Oryziasmelastigma；ocean acidification；skeletal development

X174

A

0253-4193（2015）12-0116-07

王曉杰，肖瀟，李超，等.海洋酸化對海水青鳉胚胎骨骼發育的影響［J］.海洋學報，2015，37（12）：116—122，

10.3969／j.issn.0253-4193.2015.12.012

Wang Xiaojie，Xiao Xiao，Li Chao，et al.Impact of ocean acidification on skeletal development in embryonic marine medaka［J］.Haiyang Xuebao，2015，37（12）：116—122，doi：10.3969／j.issn.0253-4193.2015.12.012

2015-02-09；

2015-09-29。

國家自然科學基金項目（41306097）；中國科學院海洋生態與環境科學重點實驗室開放課題（KLMEES2013）。

王曉杰（1979—），女，山東省龍口市人，講師，研究方向：海洋生態學、魚類神經生物學。E-mail：xj-wang＠shou.edu.cn