HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定消乳增膠囊的三種活性成分*

王 銳，陸 鋮，葛 斌，袁繼勇，高慶劍，湯 浩△

1甘肅省人民醫(yī)院藥劑科，甘肅 蘭州 730000；2寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院

HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定消乳增膠囊的三種活性成分*

王 銳1，2，陸 鋮1，2，葛 斌1，袁繼勇1，高慶劍1，2，湯 浩1△

1甘肅省人民醫(yī)院藥劑科，甘肅 蘭州 730000；2寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院

目的：建立HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定消乳增膠囊中的多種活性成分。方法：采用DAD全波長(zhǎng)掃描，色譜柱為Gemini C18(250mmx4.60mm,5μm)，流動(dòng)相為乙腈，甲醇為10：90(A)-0.5%冰醋酸水溶液(B)梯度洗脫，流速為0.8mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。結(jié)果：甘草苷線(xiàn)性范圍為1.25～40μg/mL，平均回收率為98.51%，RSD為0.81%；橙皮苷線(xiàn)性范圍為2.5～80μg/mL，平均回收率為98.10%，RSD為1.32%；歐前胡素線(xiàn)性范圍為5～160μg/mL，平均回收率為98.92%，RSD為0.76%。結(jié)論：該HPLC-DAD方法能有效測(cè)定消乳增膠囊中甘草苷、橙皮苷及歐前胡素的主要活性成分含量，且快速、準(zhǔn)確。

HPLC-DAD；“消乳增”膠囊；橙皮苷；甘草苷；歐前胡素

消乳增膠囊由甘肅省人民醫(yī)院自主研發(fā)，臨床應(yīng)用10余載，由甘草、青皮、陳皮、白芷等17味中藥組成，具有行氣解瘀、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌失調(diào)的功能，常用于治療乳癰、乳腺增生癥等。經(jīng)多年臨床使用，現(xiàn)已在處方改進(jìn)方面積累了經(jīng)驗(yàn)，鑒于僅對(duì)白芍有效成分芍藥苷建立了H P L C測(cè)定方法［1］，已不能滿(mǎn)足制劑改進(jìn)后的全面質(zhì)控和藥效學(xué)機(jī)制深入研究的要求，本研究采用H P L C-D A D法優(yōu)選色譜條件，最終選取以甘草苷、橙皮苷、歐前胡素為指標(biāo)的多種活性成分色譜同時(shí)定量方法，為該制劑的進(jìn)一步改進(jìn)及質(zhì)量控制等方面提供方法學(xué)支持。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 美國(guó)A g il e n t公司1100系列高效液相色譜儀(配置G1312A二元梯度泵、G1313A自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、G1315B二極管陣列檢測(cè)器及A g il e n t C h e m S tat i o n f or L C 3D R e v A.10.02色譜工作站)；電子分析天平［梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司］；超聲清洗儀(上海科導(dǎo)有限公司)。

1.2 試劑 消乳增膠囊(甘肅省人民醫(yī)院自制，批號(hào)：20101108)；橙皮苷對(duì)照品(批號(hào)：110721-201014)、甘草苷對(duì)照品(批號(hào)：111610-201057)、歐前胡素對(duì)照品(批號(hào)：110826-201013)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；三蒸水為自制；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱G e m ini C18(250mm×4.60mm，5μm)柱；流動(dòng)相為乙腈；甲醇=10∶90(A)-0.5%冰醋酸水溶液(B)，梯度洗脫，20%A(0～5m in)，20%～40%A(5～10 m in)，40%A(10～15 m in)，40%～60%A (15～20m in)。60%A(20～50m in)；流速為0.8m L/m in；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 n m；柱溫為室溫，見(jiàn)圖1。

圖1 消乳增三種指標(biāo)成分同時(shí)測(cè)定色譜圖

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密秤取甘草苷、歐前胡素各20m g置于10m L容量瓶中，取橙皮苷20m g置于100m L容量瓶中，分別用甲醇溶解并定容至刻度，得單一對(duì)照品溶液。分別取0.1m L甘草苷對(duì)照品溶液，2m L橙皮苷對(duì)照品溶液，0.4m L歐前胡素對(duì)照品溶液，置于5m L容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得混合對(duì)照品溶液。

2.3 樣品溶液的制備 取20粒消乳增膠囊內(nèi)容物，混合均勻，精密秤取粉末0.5 g置于5m L容量瓶中，用甲醇超聲30分鐘溶解，待溶液放冷，用甲醇定容至刻度，濾紙過(guò)濾，進(jìn)樣前用0.45μm濾膜過(guò)濾，既得樣品溶液。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按消乳增膠囊處方量取無(wú)甘草、青皮、陳皮、白芷的藥材，按消乳增膠囊制備方法制備陰性樣品，再按“2.3”項(xiàng)下樣品溶液制備方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.5 線(xiàn)性關(guān)系考察 取混合對(duì)照品溶液作為“1號(hào)”對(duì)照溶液，采用倍比稀釋法，精密吸取“1號(hào)”對(duì)照溶液1m L于2m L容量瓶中，加甲醇定容至刻度得到“2號(hào)”混合對(duì)照溶液，依次配出“3號(hào)”“4號(hào)”“5號(hào)”“6號(hào)”混合對(duì)照溶液。精密吸取各混合對(duì)照溶液20μL進(jìn)樣，進(jìn)行色譜測(cè)定，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行色譜分析，以進(jìn)樣量(Y，μg/m L)對(duì)峰面積(X，A)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，分別得甘草苷回歸方程為y=54.205x+14.396，r=0.999 5，n=6，線(xiàn)性范圍為1.25～40μg/m L；橙皮苷回歸方程為y=34.593x+72.438，r=0.999 4，n=6，線(xiàn)性范圍為2.5～80μg/m L；歐前胡素的 回歸方程為y=28.895x+147.77，r=0.9992，n=6，線(xiàn)性范圍為5～160μg/m L。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一樣品，按“2.3”項(xiàng)制備樣品溶液，依“2.1”項(xiàng)的色譜條件進(jìn)樣，分別在0、4、8、12、16、24小時(shí)進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。結(jié)果：甘草苷峰面積的RS D=0.78%；橙皮苷峰面積的RS D=1.09%；歐前胡素峰面積的RS D=2.38%。

2.7 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一濃度混合對(duì)照溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積，結(jié)果甘草苷峰面積的RS D=1.67%；橙皮苷峰面積的RS D=2.42%；歐前胡素峰面積的RS D=1.28%。

2.8 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 取同一批次樣品6份，按“2.3”項(xiàng)制備樣品溶液，依“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，結(jié)果甘草苷峰面積的RS D=1.47%；橙皮苷峰面積的RS D=0.69%；歐前胡素峰面積的RS D=2.15%。

2.9 加樣回收實(shí)驗(yàn) 精密秤取干燥至恒重的消乳增膠囊粉末0.5g精確加入一定量的對(duì)照溶液，按“2.3”項(xiàng)下制備方法制備樣品溶液，依“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣20μL，結(jié)果見(jiàn)表1—3。

表1 甘草苷的回收率

表2 橙皮苷的回收率

表3 歐前胡素的回收率

2.10 樣品含量測(cè)定 精密秤取3批消乳增膠囊各3份，每份0.5 g，按“2.3”項(xiàng)下制備方法制備樣品溶液，依“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣20μL，計(jì)算甘草苷、橙皮苷、歐前胡素的含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

消乳增膠囊在我院臨床應(yīng)用多年，發(fā)揮了特色中藥制劑的優(yōu)良品質(zhì)，彌補(bǔ)了西醫(yī)治療乳腺增生療效的不足。依成方組分特點(diǎn)，甘草具有補(bǔ)脾益氣，清熱解毒，緩急止痛，調(diào)和諸藥的作用，其活性成分甘草苷具有解痙和抗腫瘤作用［2-3］；陳皮具有降氣寬中，健脾溫胃的功效，其活性成分橙皮苷有神經(jīng)保護(hù)和抗纖維化作用［4-5］；白芷具有祛風(fēng)除濕，通竅止痛，消腫排膿的功效，其活性成分歐前胡素具有血管舒張、抗腫瘤及緩解痛經(jīng)的作用［6-8］。本研究采用H P L C法同時(shí)對(duì)3種君藥有效成分甘草苷、橙皮苷、歐前胡素的含量進(jìn)行測(cè)定，所建方法快捷、準(zhǔn)確，有利于“消乳增”膠囊的質(zhì)量控制及組方改進(jìn)后藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的進(jìn)一步研究。

在實(shí)驗(yàn)中參考相關(guān)文獻(xiàn)［8-14］，以?xún)?yōu)化橙皮苷和甘草苷的分離度，考察了多種流動(dòng)相體系，如甲醇∶水系統(tǒng)，乙腈∶水系統(tǒng)，甲醇∶冰醋酸∶水系統(tǒng)，乙腈∶冰醋酸∶水系統(tǒng)，乙腈∶甲醇∶冰醋酸∶水系統(tǒng)等，比較各個(gè)組分的保留時(shí)間和分離度，結(jié)果顯示在乙腈∶甲醇=10∶90(A)-0.5%冰醋酸水溶液(B)條件下最好。以基線(xiàn)分離為原則，對(duì)不同梯度洗脫程序進(jìn)行優(yōu)化。確定最終洗脫程序?yàn)?0%A(0～5m in)，20%～40%A(5～10m in)，40%A(10～15m in)，40%～60% A(15～20m in)，60%A(20～50m in)；以上條件下消乳增膠囊能夠排除雜質(zhì)峰的干擾，達(dá)到基線(xiàn)分離，見(jiàn)圖2—3。

圖2 色譜流動(dòng)相體系篩選

圖3 色譜流動(dòng)相梯度篩選

本實(shí)驗(yàn)利用D A D多波長(zhǎng)掃描功能，對(duì)多種活性成分進(jìn)行最大吸收波長(zhǎng)的優(yōu)化，在280 n m時(shí)由于基線(xiàn)穩(wěn)定、重復(fù)性高，故選其為檢測(cè)波長(zhǎng)。該方法同時(shí)能對(duì)復(fù)方中藥的3種活性成分進(jìn)行定量，定量指標(biāo)更全面，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，更具參考意義。

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Determ ination of Three Active Com ponents in XiaoRuZeng Capsulesby HPLC-DAD M ethod

WANG Rui1,2,LU Cheng1,2,GE Bin1,Yuan Jiyong1,GAO Qingjian1,2,TANG Hao1△
1 Pharnacy Departmentof Gansu People′s Hospital,Lanzhou 730000,China; 2 Pharmacy College of Ningxia Medical University

Objective:To determine themulti-active components in XiaoRuZeng capsules by a HPLC-DAD method.Methods:W ith DAD fullwavelength scan,the determ ined conditionswere follows:chromatographic column:Gem iniC18(250mm×4.60mm);mobile phase:acetonitrite/methanol(10:90)(A)and 0.5%acetic acid(B) w ith gradientelution;flow rate:0.8m L/min;detection wavelength:280 nm.Results:The results revealed that the linear range of liquiritin was 1.25～40μg/m L,the average recovery 98.51%aswell as RSD 0.81%,the linear range ofhesperidinwas2.5～80μg/m L,the average recovery 98.10%aswellas RSD 1.32%and the linear range of imperatorin was 5～160μg/m,the average recovery 98.92%aswellas RSD 0.76%.Conclusion:The HPLC-DAD method isaccurate and easy in determining themain componentsof XiaoRuZeng capsules like hesperidin,liquiritin and imperatorin.

HPLC-DAD;XiaoRuZeng capsules;hesperidin;liquiritin;imperatorin

R285

A

1004-6852(2015)03-0025-04

2014-08-28

甘肅省中醫(yī)藥科研立項(xiàng)課題(編號(hào)GZK-2010-4)；甘肅省省自然科學(xué)研究基金計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)1107RJZA130)。

王銳(1990—)，男，在讀碩士研究生。研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

△通訊作者：湯浩(1975—)，女，博士學(xué)位，碩士研究生導(dǎo)師，副主任藥師。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)和中藥新藥開(kāi)發(fā)。