康腎合劑對酒精性腎損害大鼠腎組織NF-κB活化及IL-6水平的影響*

胡曉琴，邱 皓△，呂曉云，劉 文，李艷芬，滕玉蓮，陶小紅

1甘肅省第二人民醫院，甘肅 蘭州 730000；2蘭州大學

康腎合劑對酒精性腎損害大鼠腎組織NF-κB活化及IL-6水平的影響*

胡曉琴1，邱 皓1△，呂曉云2，劉 文1，李艷芬1，滕玉蓮2，陶小紅1

1甘肅省第二人民醫院，甘肅 蘭州 730000；2蘭州大學

目的：探討中藥康腎合劑(KSP)對酒精性腎損害模型大鼠腎組織核轉錄因子κB(NF-κB)活化及白細胞介素6(IL-6)水平的影響。方法：將SD雄性大鼠66只隨機分為正常組、酒精組、中藥組各22只。正常組給予生理鹽水灌胃，酒精組給予無水乙醇每日2次灌胃，中藥組在給予同酒精組等量乙醇基礎上，加用KSP水煎劑每日2次灌胃，共12周。于實驗第4周、8周、I2周末采用免疫組化法及ELISA法檢測腎組織NF-κB活化及IL-6水平變化。結果：酒精組大鼠腎組織NF-κB活化較正常組顯著上調，IL-6水平明顯上升(P＜0.05)；中藥組NF-κB活化及IL-6水平明顯低于酒精組(P＜0.05)。結論：KSP干預酒精性腎損害的作用機制可能與其抑制NF-κB活化、降低IL-6水平有關。

酒精性腎損害；康腎合劑；核轉錄因子κB；白細胞介素6

過量飲酒是世界范圍內的一個重要公共衛生問題。相關研究證實，乙醇可誘發以腎小管-間質損害為主的腎臟病理改變，其結果可進展至腎間質纖維化、慢性腎功能衰竭［1］。本課題組以往研究發現，復方中藥活血利濕方對大鼠酒精性腎損害具有良好的干預作用［2］。本研究在建立酒精性腎損害動物模型的同時，以復方中藥康腎合劑(Ka n g s h e n P rescr ip t i o n，K S P)灌胃，研究K S P對酒精性腎損害模型大鼠腎組織核轉錄因子κB (N F-κB)活化及血清白細胞介素6(I L-6)水平的影響，進一步探討K S P干預酒精性腎損害的可能機制，為K S P臨床應用提供新的實驗室依據。

1 材料與方法

1.1 材料 無水乙醇(分析純，沈陽化學試劑廠)；小鼠抗大鼠N F-κB p65多克隆抗體(美國S a n ta C r u z公司，武漢博士德生物工程有限公司分裝)；免疫組化檢測試劑盒 (武漢博士德生物工程有限公司提供)；大鼠I L-6 E L I S A試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司提供)；K S P藥物組成：黃芪50g，當歸20 g，枸杞子20 g，紅花15 g，連翹20 g，白茅根30 g，薏苡仁30 g。藥物均購自甘肅省藥材公司，經鑒定符合國家藥典標準。加5倍體積水，煎30分鐘，同法煎煮2次，2次煎煮藥液混合(含生藥2.6 g/m L)，冷藏備用，采用高效液相控制藥物質量。

1.2 動物分組、模型復制及給藥方法 清潔級S D雄性大鼠66只，體質量(180±20)g，由蘭州大學醫學實驗動物中心提供(甘動準14-006)。動物分組、模型復制及給藥方法參照文獻［2］方法進行。

1.3 免疫組織化學染色(SP)法 分別取灌胃4周末、8周末、12周末正常組大鼠各6只及酒精組、中藥組各8只，斷頭處死，迅速摘取腎臟，制備腎組織切片。切片經常規脫蠟水洗，3%H2O2封閉內源性過氧化物酶，微波抗原修復，加小鼠抗大鼠N F-κB p65多克隆抗體一抗(1∶75)，標本置濕盒內4℃過夜，滴加生物素化羊抗兔二抗I g G(1∶100)，滴加辣根過氧化物酶標記鏈霉素卵白素，D A B顯色，蘇木精復染細胞核，常規脫水，透明，中性樹膠封片。以P B S代替一抗作陰性對照，以博士德公司提供的扁桃腺切片作陽性對照。每鼠6張切片。應用彩色病理圖文分析系統，通過光學顯微鏡放大400倍攝取圖像，輸入圖像分析系統內，分別進行腎小球與腎小管中N F-κB活化檢測：每張切片隨機選取5個腎小球，計算每個腎小球中染色區域面積占整個腎小球面積的百分比，以均值表示每例腎小球中陽性信號面積；計算每張切片皮質區60個高倍視野下陽性小管數與總腎小管數的百分數，以均值表示每例腎小管中的陽性率。

1.4 ELISA法檢測IL-6 分別于灌胃4、8、12周末處死動物，留取腎臟，制備腎組織勻漿，參照試劑盒說明書進行檢測。另取上清液，采用美國P i erce公司蛋白分析試劑盒測定上清液蛋白含量。結果判定：腎組織I L-6蛋白含量(n g/g)=腎組織勻漿上清液I L-6濃度(n g/L)/組織勻漿上清液蛋白定量(g/L)。

1.5 統計學方法 數據采用S P SS 13.0統計學軟件進行處理，計量資料以(±s)表示，組間比較采用方差分析，組間多重比較采用L S D-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 KSP對酒精性腎損害模型大鼠腎組織NF-κB活化的影響 鏡下胞漿或胞核出現棕黃色顆粒，表明存在腎組織N F-κB活化。正常組可見少部分腎小球系膜細胞和遠端腎小管上皮細胞有微弱N F-κB活化；酒精組腎小球系膜細胞、髓質區腎小管上皮細胞和集合管有較強活化，活化信號位于胞漿及胞核核周；中藥組腎組織中N F-κB活化信號低于酒精組(P＜0.05)，見表1。

2.2 KSP對酒精性腎損害模型大鼠腎組織IL-6水平的影響 隨著酒精刺激時間的延長和劑量的不斷加大，酒精組I L-6水平較正常組升高(P＜0.05)，與酒精組比較，中藥組I L-6顯著降低，接近正常組(P＜0.05)，見表2。

表1 腎組織中NF-κB活化情況(±s) %

表1 腎組織中NF-κB活化情況(±s) %

注：與正常組比較，△表示P＜0.01；與酒精組比較，#表示P＜0.05,##表示P＜0.01。

組別例數 4周 8周 12周腎小球 腎小管 腎小球 腎小管 腎小球 腎小管正常組 18 1.52±0.42 7.32±2.19 1.63±0.48 8.24±4.51 1.69±0.47 8.36±2.65酒精組 24 15.24±4.53△37.63±10.32△31.28±8.19△54.38±14.28△46.71±14.78△69.85±8.23△中藥組 24 9.72±2.62#24.36±7.09#13.18±3.76##28.14±7.51##14.67±4.92##29.36±8.65##

表2 腎組織IL-6水平變化情況(±s) ng/g

表2 腎組織IL-6水平變化情況(±s) ng/g

注：與正常組比較，△表示P＜0.01；與酒精組比較，#表示P＜0.05,##表示P＜0.01。

組別 例數 IL-6 4周 8周 12周正常組 18 325.64±83.12 336.72±92.34 338.69±91.81酒精組 24 413.57±112.73△442.85±113.45△462.27±121.68△中藥組 24 382.16±102.43#375.36±108.15##347.81±89.27##

3 討論

業已證實，炎癥反應與酒精性腎損害密切相關。N F-κB是真核細胞基因轉錄中重要的因子。活化的N F-κB可誘導多種炎癥性細胞因子、趨化因子(如I L-6、M C P-1)、細胞黏附分子及細胞外基質成分等的基因表達，參與腎損害的發病過程［3］。因此，N F-κB作為上游調控因子，在酒精性腎損害的發生發展過程中起至關重要作用，而抑制N F-κB活性，可從基因水平上抑制腎損害［4］。I L-6在腎小球硬化、腎小管萎縮和腎間質纖維化的過程中起重要促進作用，可誘導上皮細胞其他細胞因子的表達，從而催化和放大炎癥反應。在多種腎臟疾病中，I L-6可促進其發展，其在腎臟中的高表達與腎小球系膜增生、腎小管萎縮呈正相關［5］，其分泌與M C P-1的調控有關［6］。本研究結果顯示，隨著酒精負荷時間的延長，大鼠腎組織N F-κB活化逐漸增強，活化的N F-κB主要表達于腎小管上皮細胞和間質細胞，僅有少量表達于腎小球固有細胞，并伴隨腎功能損害，此與相關文獻報道一致［7］。尤以腎小管為著，同時伴隨血清I L-6的升高。經K S P灌胃干預后，N F-κB表達明顯減弱，其下游炎癥相關因子I L-6水平亦顯著降低。結合本課題組以往研究［8］，認為復方中藥K S P(同活血利濕方)正是通過N F-κB信號通路，下調M C P-1、I L-6的表達，達到抑制酒精性腎損害的目的。

中醫學認為，酒辛而溫熱，少則鼓舞氣血，通暢經絡，有助氣機，多則釀濕生痰，久而導致氣滯血瘀。濕瘀互結，久羈體內，必傷氣血，變證百出，表現為正虛(氣、血)邪實(瘀、濕)之病機。K S P方中黃芪、當歸、枸杞益氣養血；當歸、紅花活血化瘀，連翹、白茅根、薏苡仁清利濕熱，合奏扶正祛邪之功。國內研究證實，黃芪、當歸等補益藥為主組成的復方以及化瘀解毒類中藥復方具有明顯的抗腎纖維化作用［9-11］。本研究結果提示，K S P在減輕酒精造成的腎臟病理損害的同時［2］，可通過N F-κB、I L-6等靶點而發揮干預酒精性腎損害的作用，顯示出良好的抗酒精性腎纖維化潛能。

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Effectsof KangShen Prescription on the NF-κB Activation and IL-6 Level in Ratsw ith Alcoholic RenalDam age

HU Xiaoqin1,QIU Hao1△,LYU Xiaoyun2,LIUWen1,LIYanfen1,TENG Yulian2,TAO Xiaohong1
1 The Second People′s Hospital of Gansu Province,Lanzhou 730000,China; 2 Lanzhou University

Objective:To study the effectof KangShen prescription(KSP)on the activation of nuclear factor kappa-B (NF-κB)and the levelof Interleukin 6(IL-6)in ratsofalcoholic renaldamage.Methods:The66male SD ratswere randomized into normal,alcoholic and Chinesemedicalgroupsw ith 22 cases in each.The normal salines were given to the ratsof normalgroup by gavage,the ethanol for tw ice a day to the ratsof alcoholic group and KSP based on the ethanolequal to the amountof the alcoholic group to the rats of Chinesemedicalgroup for tw ice day, w ith 12 weeks course.At the end of 4th,8th and 12th week,the NF-κB activation and IL-6 levelswere determined by immunohistochemical and ELISA methods.Results:Compared w ith the normal group,the activation of NF-κB and the level of IL-6 in rats renal tissues of alcoholic group significantly wentup(P＜0.05);those in the Chinese medicalgroup weremarkedly lower than in thealcoholic group(P＜0.05).Conclusion:KSP intervention for patients w ith alcoholic kidney damagemay be relevant to its functions in inhibiting the activation of NF-κB and decreasing the levelof IL-6.

alcoholic renaldamage;Chinesemedicine;KSP;NF-κB;IL-6

R965

A

1004-6852(2015)03-0011-03

2014-01-30

2011年甘肅省自然科學基金項目(編號1007RJZA085)

胡曉琴(1968—)，女，主治醫師。研究方向：兒童腎病的診治。

△通訊作者：邱皓(1966—)，男，主任醫師。研究方向：腎內科疾病的中西醫結合治療。