新加糖腎康對高糖環境下HK-2細胞TGF-β/Smads信號通路的影響*

程 濤，權 卓，楊麗霞，田廣芳，張定華，劉銅華

1甘肅省中醫藥研究院，甘肅 蘭州 730050；2中國解放軍第十醫院；3甘肅省中醫院；4北京中醫藥大學

新加糖腎康對高糖環境下HK-2細胞TGF-β/Smads信號通路的影響*

程 濤1，權 卓2，楊麗霞1，田廣芳3，張定華3，劉銅華4

1甘肅省中醫藥研究院，甘肅 蘭州 730050；2中國解放軍第十醫院；3甘肅省中醫院；4北京中醫藥大學

目的：通過觀察新加糖腎康（TSK）對高糖環境培養下人腎小管上皮細胞（H K-2）TG F-β/Sm ads信號通路的影響，探討其防治糖尿病腎病的作用機制。方法：體外培養H K-2細胞，培養基為含10%胎牛血清的1640培養基，實驗分為6組：空白對照組、高糖組（30 m m ol/LD-葡萄糖）、空白血清對照組（30 m m ol/LD-葡萄糖+10%空白血清）、新加糖腎康低劑量組（30 m m ol/L D-葡萄糖+5%TSK藥物血清）、新加糖腎康中劑量組（30 m m ol/LD-葡萄糖+10%TSK藥物血清）、新加糖腎康高劑量組（30 m m ol/LD-葡萄糖+20%TSK藥物血清）。ELISA法檢測轉化生長因子-β1（TG F-β1）、轉化生長因子-β受體I（TG F-βRⅠ）、轉化生長因子-β受體Ⅱ（TG F-βRⅡ）、Sm ad2、Sm ad3的表達。結果：H K-2細胞經高糖環境培養后TG F-β1、TG F-βRⅠ、TG F-β RⅡ、Sm ad2、Sm ad3的含量顯著增加，與空白對照組相比差異有統計學意義（P＜0.05）。但經新加TSK干預后其含量下降，與高糖組相比差異有統計學意義（P＜0.05）。結論：中藥復方TSK能夠抑制腎小管上皮細胞TG F-β/Sm ads信號通路，具有防治糖尿病腎間質纖維化的作用。

新加糖腎康；高糖；人腎小管上皮細胞；TG F-β/Sm ads通路

糖尿病腎病(DN)是糖尿病最常見的并發癥之一，其發病率高，危害大，在糖尿病所有并發癥中占主要地位，直接關系著糖尿病患者的生活質量。截至目前，國內外進行了大量DN的研究，但對其發病機制尚未完全解釋清楚。近年研究發現，腎間質纖維化與DN密切相關［1］。因此，通過干預腎間質纖維化預防DN的研究逐漸興起，特別是有關中醫藥的研究越來越多。

中藥復方新加糖腎康是在甘肅省中醫院劉國安和張定華主任醫師研究的基礎上，結合北京中醫藥大學劉銅華教授治療DN的學術思想［2-3］，經過組方優化，最終確立的臨床經驗方，全方具有“益氣養陰，清熱祛濕，活血化瘀”的功效。前期臨床研究發現，糖腎康對2型糖尿病患者血液流變學指標具有一定的改善作用，并能減少尿微量白蛋白，對DN患者具有較好的臨床療效。本課題組前期研究發現，新加糖腎康能夠減少高糖環境培養下人腎小管上皮細胞的細胞外基質成分Ⅰ型膠原(ColⅠ)、Ⅲ型膠原(ColⅢ)和纖連蛋白(FN)的分泌與沉積，并能調控纖維化因子基質金屬蛋白酶-9 (MMP-9)及其抑制劑-1(TIMP-1)的分泌與釋放［4-5］。本課題在此研究基礎上，繼續觀察其對高糖環境下培養的人腎小管上皮細胞TGF-β/Smads信號通路的影響，進一步揭示其治療DN的分子機制。

1 材料與方法

1.1 動物與細胞株 SPF級雄性Wistar大鼠20只，體質量(200±20)g，購于甘肅中醫學院動物中心，許可證號：SCXK(甘)2011-0001，飼養于甘肅省中醫藥研究院中藥研究所動物室。人腎小管上皮細胞株(HK-2)購于上海斯信生物科技有限公司，培養于甘肅省中醫藥研究院中心實驗室細胞培養室中。

1.2 藥品與試劑 1640培養基(Gibco公司，批號：1237579)；胎牛血清(Gibco公司，批號：12657-029)。人TGF-β1ELISA試劑盒(批號：E9372Hu)；TGF-β RⅠELISA試劑盒 (批號：E3571Hu)；TGF-β RⅡELISA試劑盒(批號：E3572Hu)；Smad2 ELISA試劑盒(批號：E2911Hu)；Smad3 ELISA試劑盒(批號：E2912Hu)，生產廠家均為上海晶天生物科技有限公司。D-葡萄糖(汕頭西隴化工廠有限公司，批號：0810142)，用時配成30 mmol/L的濃度［6］。新加糖腎康所用中藥材購于甘肅省中醫院藥劑科，主要組成有黃芪、生地黃等藥材，用時水提醇沉，冷藏備用。

1.3 主要儀器 二氧化碳培養箱(型號：MCO-18AIC，廠家：SANYO，日本)；超凈生物安全柜(型號：SW-CJ-2FD，廠家：蘇凈安泰，中國)；倒置顯微鏡(型號：IX51，廠家：Olympus，日本)；酶標儀(型號：MS 352，廠家：Labsystems，芬蘭)；-80℃超低溫冰箱(型號：MDF-U53V，廠家：SANYO，日本)；立式滅菌器(型號：LMQ.CV，廠家：山東新華，中國)。

1.4 方法

1.4.1 新加TSK藥物血清制備方法 20只雄性Wistar大鼠隨機分為：空白組和藥物組，每組10只。藥物組采用新加TSK灌胃，劑量為成人臨床用量的6.5倍；空白組采用同體積生理鹽水灌胃。每次灌胃體積為0.01 mL/g(體質量)。早、晚各1次，持續3天。最后1次灌胃前禁食，不禁水，在灌胃30分鐘后，大鼠股動脈無菌采血，冷凍離心吸取血清，裝入EP管中，-20℃保存備用。

1.4.2 H K-2細胞培養及實驗分組 HK-2細胞培養于37℃、5%CO2培養箱中，培養基為含10%胎牛血清的1640培養基。每天在顯微鏡下觀察細胞生長狀態，及時更換新鮮培養基，待細胞生長融合達到80%以上，用含0.25%胰蛋白酶、0.05%EDTA的消化液消化，顯微鏡下觀察細胞消化程度，及時拍落消化的細胞，用完全培養基終止消化，低速離心5分鐘，用新鮮培養基將細胞吹打均勻后進行傳代培養。實驗分為6組，空白對照組：1640培養液培養；高糖組：在1640培養液中加入30 mmol/L D-葡萄糖，對細胞進行高糖環境下培養；空白血清對照組：在高糖組的基礎上，加入10%空白血清，對細胞進行干預性培養；新加糖腎康低、中、高劑量組：在高糖組的基礎上，分別加入5%、10%、20%新加TSK藥物血清，對細胞進行干預性培養。

1.4.3 指標檢測 采用ELISA法檢測細胞培養上清中TGF-β1、TGF-β RⅠ、TGF-β RⅡ、Smad2和Smad3的含量。

1.4.3.1 樣本制備 將傳代培養的細胞吹打均勻，接種在24孔細胞培養板中，劑量為1 mL，每組3孔，接種2板。2小時后在顯微鏡下觀察細胞貼壁狀態。培養24小時后吸棄上清。每組加入1 mL含藥培養液，繼續培養。培養24、48小時，仔細吸取每孔細胞上清于1.5 mL的EP管中，4℃離心，取上清，低溫保存待測。

1.4.3.2 指標檢測方法 按照ELISA試劑盒說明書進行。檢測前將樣本置室溫慢慢融化，在反應條孔中加入標準品或待測標本，每孔劑量為100μL。在空白對照孔加入100 μL稀釋液。在37℃培養箱中孵育，孵育后洗滌反應板，最后加酶標抗體進行酶聯免疫反應。反應終止后，以空白對照孔調零，在酶標儀450 nm處測定各孔OD值。

1.5 統計學方法 數據采用SPSS 13.0統計軟件進行單因素方差分析，計量資料以(±s)表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

各組HK-2細胞經ELISA檢測后顯示：正常培養的HK-2細胞經高糖培養24、48小時后，TGF-β/ Smads信號通路上的蛋白分子TGF-β1、TGF-β RⅠ、TGF-β RⅡ、Smad2和Smad3的含量顯著增加，高糖培養48小時時，各蛋白分子的含量更多，與空白對照組相比差異有統計學意義(P＜0.05)；但在新加TSK干預性培養后，其含量開始減少，并且隨著藥物劑量的增加及作用時間的延長，藥效逐漸加強，特別是在藥物高劑量、作用48小時時，效果更為明顯，與高糖組相比差異有統計學意義(P＜0.05)。而空白血清對照組則無此作用。結果表明，新加TSK能夠抑制高糖環境下人腎小管上皮細胞TGF-β/Smads信號通路，在一定程度上抑制了糖尿病腎間質纖維化的發展，見表1—5。

表1 各組H K-2細胞不同時間TG F-β1的含量比較(±s) ng/L

表1 各組H K-2細胞不同時間TG F-β1的含量比較(±s) ng/L

注：*表示與空白對照組相比，P＜0.05；△表示與高糖組相比，P＜0.05。

組別 只數 24 h 48 h空白對照組 3 29.344±8.770 30.866±2.616高糖組 3 94.144±5.001*111.921±2.377*空白血清對照組 3 29.942±3.218△28.093±4.625△新加糖腎康低劑量組 3 90.502±7.529*76.041±1.876*△新加糖腎康中劑量組 3 88.056±11.137*77.564±1.876*△新加糖腎康高劑量組 3 83.652±8.781*72.671±7.195*△

表2 各組H K-2細胞不同時間TG F-β RⅠ的含量比較(±s) ng/L

表2 各組H K-2細胞不同時間TG F-β RⅠ的含量比較(±s) ng/L

注：*表示與空白對照組相比，P＜0.05；△表示與高糖組相比，P＜0.05。

組別 只數 24 h 48 h空白對照組 3 442.954±72.263 485.661±17.491高糖組 3 848.671±101.098*1070.881±21.592*空白血清對照組 3 436.948±70.066△404.918±50.526△新加糖腎康低劑量組 3 755.916±58.342*707.204±50.048*△新加糖腎康中劑量組 3 683.848±79.506*695.192±46.174*△新加糖腎康高劑量組 3 609.111±69.722△497.005±86.268△

表3 各組H K-2細胞不同時間TG F-β RⅡ的含量比較(±s) ng/L

表3 各組H K-2細胞不同時間TG F-β RⅡ的含量比較(±s) ng/L

注：*表示與空白對照組相比，P＜0.05；△表示與高糖組相比，P＜0.05。

組別 只數 24 h 48 h空白對照組 3 402.842±49.284 367.093±28.694高糖組 3 712.308±25.727*845.698±61.127*空白血清對照組 3 344.684±46.457△370.828±70.212△新加糖腎康低劑量組 3 625.870±19.297*558.642±31.786*△新加糖腎康中劑量組 3 620.535±95.894*546.370±51.181*△新加糖腎康高劑量組 3 480.208±25.926△417.248±52.188*△

表4 各組H K-2細胞不同時間Sm ad2的含量比較(±s) ng/L

表4 各組H K-2細胞不同時間Sm ad2的含量比較(±s) ng/L

注：*表示與空白對照組相比，P＜0.05；△表示與高糖組相比，P＜0.05。

組別 只數 24 h 48 h空白對照組 3 273.212±17.254 370.347±49.673高糖組 3 657.410±13.259*841.368±56.214*空白血清對照組 3 332.361±65.145△344.300±49.163△新加糖腎康低劑量組 3 619.424±50.151*586.322±52.860*△新加糖腎康中劑量組 3 554.306±60.014*558.647±75.666*△新加糖腎康高劑量組 3 458.256±27.192*△373.603±46.589△

表5 各組H K-2細胞不同時間Sm ad3的含量比較(±s) ng/L

表5 各組H K-2細胞不同時間Sm ad3的含量比較(±s) ng/L

注：*表示與空白對照組相比，P＜0.05；△表示與高糖組相比，P＜0.05。

組別 只數 24 h 48 h空白對照組 3 277.418±19.498 350.608±39.562高糖組 3 692.518±57.764*837.829±35.706*空白血清對照組 3 371.443±55.527△316.417±92.657△新加糖腎康低劑量組 3 564.836±86.995*570.712±74.538*△新加糖腎康中劑量組 3 534.919±46.955*517.823±23.610*△新加糖腎康高劑量組 3 425.401±29.085△406.169±30.296△

3 討論

近年研究認為，糖尿病腎病(DN)的形成與發展與腎間質纖維化密切相關。腎間質纖維化(renal interstitial fibrosis，RIF)是所有腎臟疾病發展進行到終末期的共同病理改變的基礎。其形成與多種病理因素相關，最為常見的有高血壓、高血糖、蛋白尿、氧化應激及各類纖維化因子等。這些病理因素通過特定的信號通路引起腎小管上皮細胞轉分化，致使上皮細胞的形態發生改變，成為另一種新的細胞。腎小管上皮細胞轉分化后，主要變為肌成纖維細胞，這是細胞外基質成分的主要來源，也是纖維化形成的主要特征［7］。因此，干預腎小管上皮細胞轉分化、抑制腎間質纖維化成為防治DN的主要途徑。

腎小管上皮細胞轉分化過程中起關鍵作用的是TGF-β，已被公認為纖維化最主要的誘導因子，且其他細胞因子均通過調節TGF-β的表達來發揮作用。Yang等［8］研究報道，在大鼠單側輸尿管梗阻模型中，TGF-β1參與了纖維化的發展過程，誘導了腎小管上皮細胞轉分化。Fan等［9］報道，在鼠腎小管上皮轉分化中，纖維化程度隨著TGF-β劑量的增加而增強。TGF-β誘導纖維化的作用主要通過Smads信號通路來實現［10］，止消通脈寧和糖耐康干預糖尿病腎病腎間質纖維化也證實了這一觀點［11-12］。本研究發現，在高糖環境下人腎小管上皮細胞TGF-β1的含量顯著增加，其受體TGF-β RI、TGF-β RII的含量以及下游信號分子Smad2、Smad3的含量均顯著增強，與既往報道基本一致，說明Smads信號通路激活是糖尿病腎間質纖維化的機制之一。因此，抑制TGF-β/Smads信號通路是干預腎小管上皮細胞轉分化的關鍵。

目前關于腎間質纖維化的治療缺乏有效措施，許多研究仍處在初級階段，西醫研究主要集中在TGF-β中和抗體或天然拮抗劑及基因治療等方面，這些研究成本高，期限長，缺乏臨床實踐基礎，藥物應用前景難以預測。近年來，中醫藥在該方面的研究越來越多，從化濁排毒、清熱利濕、活血化瘀等多個角度開展了很多抗纖維化的基礎研究及臨床研究，涉及臨床觀察、動物實驗、細胞實驗，并取得了較好的研究效果［13］。

DN屬中醫“消渴”兼“腎病”范疇。古代醫家認為：消渴日久，臟腑氣血虛衰，水濕痰濁內停，瘀血阻絡，發為水腫尿甜。基本病機特點為“本虛標實”。本課題所選中藥復方新加糖腎康，由生黃芪、地黃等中藥組成，方中黃芪、生地黃益氣養陰，為君藥；槐米、大黃清熱祛濕，為臣藥；益母草、山楂、水蛭活血化瘀，為佐藥。其中水蛭為新增蟲類藥，加強了組方的活血化瘀作用。全方具有“益氣養陰，清熱祛濕，活血化瘀”的功效，符合DN“本虛標實”的理論基礎。本研究發現，新加糖腎康能夠抑制高糖環境培養下人腎小管上皮細胞TGF-β1超表達，進而抑制了TGF-β RI、TGF-β RII的表達，繼而抑制了其信號通路分子Smad2、Smad3的表達，最終抑制了腎間質纖維化的信號轉導，阻止了纖維化的發展，這可能是其防治糖尿病腎間質纖維化的分子機制之一。

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Influence of XinJia TangShenKang on TGF-β/Smads Signal Channel of HK-2 Cells in High Concentrations of Glucose

CHENG Tao1,QUAN Zhuo2,YANG Lixia1,TIAN Guangfang3,ZHANG Dinghua3,LIU Tonghua4
1 Gansu Provincial Academy of Chinese Medicine,Lanzhou 730050,China;
2 The Tenth Hospital of Chinese PLA;
3 Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine;4 Beijing University of Chinese Medicine

Objective:To explore the mechanism of XinJia TangShenKang (TSK)in treating diabetic nephropathy by observing its effects on TGF-β/Smads signal channel of human renal tubular epithelial cells HK-2 in high concentrations of glucose.Methods:HK-2 cells were cultivated in 1640 culture media containing 10%fetal bovine serum,they were randomized into six groups:blank control group,high glucose group (30 mmol/L D-glucose),the control group of blank serum (30 mmol/L D-glucose+10%blank serum),low dose (30 mmol/L D-glucose+5%TSK medicated serum),moderate dose(30 mmol/L D-glucose+10%TSK medicated serum)and high dose(30 mmol/L D-glucose+20%TSK medicated serum)groups of TSK.ELISA method was used to detect the expressions of TGF-β1,TGF-β RⅠ,TGF-β RⅡ,Smad2 and Smad3.Results:The contents of TGF-β1,TGF-β RⅠ, TGF-β RⅡ,Smad2 and Smad3 increased significantly after HK-2 cells cultivated in high concentrations of glucose, it had significant difference compared with blank control group(P＜0.05).The contents of these indexes decreased after intervened with XinJia TSK,and it had significant difference compared with high glucose group(P＜0.05). Conclusion:The compound TSK could inhibit TGF-β/Smads signal channel of HK-2,it could prevent and treat diabetic renal interstitial fibrosis.

XinJia TangShenKang;highglucose;humanrenaltubularepithelialcells;TGF-β/Smadssignalchannel

R587.1

A

1004-6852(2015)11-0013-04

2015-05-07

甘肅省中醫藥管理局中醫藥科學技術研究課題（編號G ZK-2011-13）。

程濤(1971—)，男，副主任醫師。研究方向：中醫內科學。