秦艽醇提物治療類風濕關節炎的實驗研究*

王 佳，王 鋼，王麗琴，王 濤，田杰祥

甘肅中醫藥大學附屬醫院，甘肅 蘭州 730000

秦艽醇提物治療類風濕關節炎的實驗研究*

王 佳，王 鋼，王麗琴，王 濤，田杰祥

甘肅中醫藥大學附屬醫院，甘肅 蘭州 730000

目的：觀察大葉秦艽醇提取物對膠原誘導性關節炎大鼠的防治作用，并探討其作用機制。方法：將SPF級SD大鼠80只隨機分為正常組、模型組、白芍組及秦艽組，每組20只。除正常組外，其余各組用膠原乳液多點皮內注射建立關節炎模型；秦艽組以秦艽乙醇提物1.8mL（kg/d）灌胃；白芍組以白芍總苷膠囊內容物混懸液2 mL（kg/d）灌胃；正常組和模型組予等量蒸餾水灌胃。實驗第24天、31天觀察各組大鼠一般情況及關節X線片變化情況。結果：模型組大鼠踝關節及足趾關節明顯腫脹、變形，秦艽組及白芍組與模型組比較關節腫脹程度明顯減輕，其差異有統計學意義（P＜0.05）。結論：秦艽提取物能在早期改善膠原誘導性關節炎大鼠的一般情況，減輕關節腫脹程度，改善滑膜炎癥狀，保護關節，體現治療早期RA的優勢。

類風濕關節炎；膠原誘導性關節炎；秦艽醇提物

類風濕關節炎 (R h e u matoid A rt h riti s,R A)是一種以慢性、對稱性、破壞性關節炎為主要特征的全身性自身免疫性疾病，其病變發生在滑膜，累及關節軟骨、韌帶、肌腱及全身組織，臨床表現為受累關節疼痛、腫脹，繼而軟骨破壞、關節間隙變窄，功能下降，晚期關節強直、畸形，功能活動障礙，最終致殘，病變呈持續、反復發作的慢性過程［1］。我國患病率約為0.32%～0.36%［2］，因缺乏特異性治療，所以致殘率高，對患者的生理、心理、日常生活等帶來不良影響，嚴重影響患者的生活質量，是造成我國人群喪失勞動力和致殘的主要病因之一，所以對類風濕關節炎發病機制的研究一直是風濕病學領域的熱點。

雖然動物模型只是模擬疾病發病，不可能完全復制人類的疾病，但是它們提供了有關自身免疫性疾病的組織學、分子生物學和遺傳學等方面的重要資料，也為新的治療藥物的研究開發起重要作用。膠原誘導性關節炎大鼠模型在臨床表現、免疫學和病理學特征方面與人類R A具有相似性［3］，因此被廣泛應用于研究R A，為研究R A的病因、發病機制及治療等提供了較好工具。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 S P F級S D大鼠80只，雌雄各半，體質量（180±20）g，由甘肅中醫藥大學S P F動物實驗中心提供，實驗動物合格證號：0000612。大鼠正常飼養1周以適應環境，隨機分出20只作為正常組，其余大鼠制作膠原誘導性關節炎（C I A）模型，將造模成功大鼠隨機分為模型組、白芍總苷膠囊治療組（白芍組）、秦艽提取物治療組（秦艽組），每組20只，各組再隨機分為免疫后24 d，31 d 2個亞組。

1.2 模型建立 造模方法[3]：牛Ⅱ型膠原蛋白20m g溶于10m L濃度為0.1mol/L的冰乙酸中，4℃過夜，冰浴下與等體積量弗氏完全佐劑充分乳化（最終Ⅱ型膠原濃度為1m g/m L）。用10%水合氯醛0.3m L/100g腹腔麻醉造模大鼠，麻醉成功后在大鼠背部、尾根部及右后足趾部多點皮內注射該乳化劑0.4m L（6～8點/只），10天后腹腔內注射上述乳劑0.2m L。

1.3 實驗藥物的制備 秦艽提取工藝[4]，將秦艽粉碎，精密稱重，置于1000m L圓底燒瓶中，加入8倍量70%乙醇，加熱、回流提取3次(每次1.5 h)；再將所得醇提液用旋轉蒸發儀回收乙醇且濃縮為每毫升含生藥0.5 g，4℃冰箱保存備用。根據實驗大鼠與人體表面積比例系數換算、確定大鼠每日服藥劑量為1.8m L。白芍總苷膠囊規格為0.3 g，由寧波麗華制藥有限公司提供，取膠囊內容物加蒸餾水2m L配置成混懸液。

1.4 給藥方法 造模后第9天開始，正常組和模型組給予等量蒸餾水灌胃；白芍組予白芍總苷膠囊內容物2 m L/（k g·d）灌胃；秦艽組予秦艽醇提物1.8m L/（k g·d）灌胃（依據人與動物體表面積換算的等效劑量）。

1.5 統計學方法 數據采用S P SS 11.5統計軟件分析，計量資料以(±s)表示，采用方差分析，檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 大鼠一般情況 模型組大鼠皮下注射膠原乳化劑及加強免疫后精神狀態、飲食情況、活動能力明顯降低，免疫5天后肉眼觀察，模型大鼠足趾和踝關節出現腫脹，7天后腫脹明顯，并日漸加重，部分大鼠右后足出現足趾變形。造模后9天開始給藥，14天后白芍組及秦艽組大鼠上述癥狀明顯緩解。

2.2 大鼠關節AI值測定結果 與正常組比較，免疫后10天開始模型組、白芍組及秦艽組大鼠后足關節腫脹明顯，A I值增高，其差異有統計學意義（P＜0.05），說明造模成功。隨著免疫時間的延長，模型組大鼠關節腫脹呈明顯遞增趨勢（P＜0.05）。給藥后1周、2周、3周白芍組及秦艽組大鼠關節腫脹減輕，A I值減小；與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠關節AI值比較（±s）

表1 各組大鼠關節AI值比較（±s）

注：與正常組同期比較，**表示P＜0.01；與模型組同期比較，▲表示P＜0.05；與本組前一時點比較，★表示P＜0.05。

組別正常組模型組白芍組秦艽組31天0 6.375±1.061☆2.000±0.756▲★1.875±0.641△★10天0 2.875±0.834**3.00±0.926**2.875±0.834**17天0 5.375±1.685☆3.500±0.926▲3.625±0.744△24天0 6.250±1.281☆3.000±1.069▲3.125±1.126△

2.3 大鼠踝關節足趾容積檢測結果 實驗第10天開始模型組、白芍組及秦艽組大鼠踝關節足趾容積明顯增大，與正常組及本組前一時間點比較，差異有統計學意義（P＜0.01），說明造模成功。隨著免疫時間的延長，模型組大鼠關節足趾容積逐漸增大，與正常組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。第17天、24天、31天白芍組及秦艽組大鼠關節足趾容積逐漸減小，與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；隨著給藥時間的延長，與第24天比較，第31天白芍組與秦艽組大鼠關節足趾容積減小明顯，其差異有統計學意義（P＜0.05）；且給藥后秦艽組與白芍組比較上述指標差異不明顯，無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 大鼠踝關節足趾容積的變化（±s）mL

表2 大鼠踝關節足趾容積的變化（±s）mL

注：與正常組同期比較，**表示P＜0.01；與模型組同期比較，▲表示P＜0.05；與本組前一時點比較，★表示P＜0.05。

組別正常組模型組白芍組秦艽組31天0.904±0.048 1.370±0.126**1.001±0.031▲★0.988±0.026▲★造模前0.815±0.068 0.808±0.053 0.793±0.076 0.811±0.073 10天0.853±0.079 1.051±0.087**1.067±0.068**1.056±0.078**17天0.871±0.064 1.192±0.071**1.072±0.040▲1.074±0.049▲24天0.892±0.045 1.264±0.112**1.049±0.034▲1.051±0.029▲

2.4 大鼠踝關節病理性觀察結果 大鼠踝關節切片，H E染色，光鏡觀察，結果顯示：正常組大鼠關節腔內無炎性滲出，滑膜無增厚、水腫，軟骨表面光整，細胞排列整齊，關節結構正常；模型組大鼠關節腔內有大量炎性滲出物，滑膜充血水腫，軟骨細胞數少且排列紊亂，軟骨面有缺損，骨質破壞；白芍組大鼠關節結構正常，無明顯骨質破壞，關節腔內有少量炎性滲出物，滑膜輕度增厚，軟骨面不平整，偶見細胞破壞，細胞數較模型組增多，軟骨細胞排列不規則；秦艽組大鼠關節腔內有少量炎性滲出物，關節結構清晰，無明顯骨質侵蝕，關節軟骨面不平整，軟骨細胞數較模型組增多，細胞排列不規則，見圖1-4。

圖1 正常組（×10）

圖2 模型組（×10）

圖3 白芍組（×10）

圖4 秦艽組（×10）

2.5 大鼠踝關節X線片觀察結果 拍攝各組大鼠右后踝關節X片，觀察大鼠踝關節宏觀結構。正常組大鼠X線顯示關節面清晰，骨質結構完整，關節間隙正常；模型組可見關節軟組織腫脹明顯、關節面不清晰、骨質破壞、關節結構缺損；白芍組關節周圍軟組織輕度腫脹，關節面毛糙，無明顯骨質破壞和新骨形成，有輕度關節間隙狹窄；秦艽組關節面光滑，關節間隙無明顯狹窄，未見明顯骨質破壞和關節結構缺損，關節周圍軟組織輕度腫脹，見圖5-8。

圖5 正常組

圖6 模型組

圖7 白芍組

圖8 秦艽組

X線片觀察可知，秦艽組與白芍組均無明顯骨質破壞，關節結構完整，且2組間表現無明顯差異，秦艽組和白芍組X線片表現均優于模型組，提示白芍總苷膠囊和秦艽提取物均可防止類風濕關節炎關節骨質破壞，有保護關節的作用。

3 討論

類風濕關節炎屬中醫學“痹證”范疇，有“頑痹”“歷節風”之稱。其基本病理改變為關節滑膜慢性炎癥形成侵襲性血管翳，破壞軟骨、骨與周圍組織呈慢性炎癥反映，是R A的顯著特征。有學者認為，促炎性Th1細胞及其分泌的I N F-γ和抗炎性Th2細胞及其分泌的I L-4失衡在R A發病機制中起重要作用[5]。研究發現，R A患者Th l及其細胞因子占優勢。應用Ⅱ型膠原蛋白混合弗氏佐劑誘導的膠原誘導性關節炎模型是研究人類R A的理想模型[6-7]，該模型除了具有R A的急性病變外，還有一定的慢性病變特征。造模大鼠后肢腫脹于致敏1周后出現，3周病變最為嚴重，少數可累及前肢，腫脹可持續3～7周，最終導致關節僵硬變形，關節病理特征與人類R A相似[8]。

秦艽為龍膽科植物秦艽Gentianamacrophylla P al l.麻花秦艽G.straminea Maxim.粗莖秦艽G. crassicaulis Duthie e x B u r k.或小秦艽G.dahurica F i s e h.的干燥根。前三者按性狀不同分別習稱“秦艽”和“麻花艽”，后一種習稱“小秦艽”。多為栽培。主產于甘肅、陜西等地。春、秋二季采挖。秦艽及麻花艽曬軟，堆置“發汗”至表面呈紅黃色或灰黃色時，攤開曬干，或不經“發汗”直接曬干；小秦艽趁鮮時搓去黑皮，曬干。均以根條粗大，肉厚、色棕黃、氣味濃厚者為佳。

秦艽味辛、苦，性平。歸胃、肝、膽經。臨床主要用于風濕痹證、筋脈拘攣、關節屈伸不利、中風不遂、骨蒸潮熱、小兒疳積發熱、濕熱黃疸等。古人稱之為“風藥中之潤劑，散藥中之補劑”，具有祛風濕、止痹痛、退虛熱、清濕熱等功效[9]。現代研究表明，秦艽主要含有生物堿、環烯醚萜苷、甾醇苷和其他成分，具有抗炎、鎮痛、鎮靜、解熱及保肝等作用，能調節中樞神經系統及免疫系統，廣泛用于風濕病、心腦血管疾病、肛腸疾病及皮膚病等的治療。

本研究以膠原誘導性關節炎大鼠（C I A）為模型，證實秦艽醇提物能夠在早期改善膠原誘導性關節炎大鼠的一般情況，減輕關節腫脹程度，改善滑膜炎癥狀，抑制C I A大鼠關節破壞，保護關節，體現治療早期R A的優勢。

[1] 石磊，李小峰，張莉蕓，等.類風濕關節炎動物模型的研究進展［J］.中國藥物與臨床,2009,9(3):215-217.

[2] 陸再英，鐘南山.內科學[M].第7版.北京:人民衛生出版社,2008:848．

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[5] Matyniak JE,Reiner SL.T helper phenotype and genetic susceptibi lity in experimental Lyme disease [J].J Exp Med.1995,181（3）:1251-1254.

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[9] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京:化學工業出版社，2010:253－254.

Experim ental Study on T reating Rheum atoid Arthritisby QinJiao A lcohol Extracts

WANG Jia,WANGGang,WANG Liqin,WANG Tao,TIAN Jiexiang
University Hospital of Gansu Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730000,China

rheumatoid arthritis;collagen-induced arthritis;alcoholextractsof QinJiao

R285.5

A

1004-6852(2015)07-0011-04

2014-10-25

甘肅省中醫藥科學技術研究課題（編號 GZK-2010 -3）。

王佳（1981—），男，碩士學位，主治醫師。研究方向：骨病的中西醫結合治療。

A b s t ra c t Objective:To observe preventive and therapeutic effects of DaYe QinJiao(Gentianamacrophylla Pall.)alcoholic extracton rats suffering from collagen-induced arthritis,and explore itsmechanism.Methods:Eighty SPFSD ratswere randomized into thenormalgroup,themodelgroup,BaiShao(White Paeony Root)group and QinJiao group,20 ratseach group.Except the normalgroup,ratsof the othergroupswere prepared bymultiple intradermal injections of collagen emulsion;QinJiao group accepted QinJiao alcoholextracts lavage in the concentration of 1.8m L (kg/d);BaiShao group totalglucosidesof peony suspension in the concentration of 2mL(kg/d);the normalgroup and themodelgroup the same amountsof distilled water lavage.Common conditionsand the changesof jointX-ray of the rats in all the groupswere observed at the 24th daysand 31stdays.Results:The ankle and toe of the rats in themodel group became swollen and deformed;the swollen degreesof jointswere obviously alleviated when QinJiao group and BaiShao group were compared w ith themodel group,the difference had statisticalmeaning（P＜0.05）.Conclusion: QinJiao alcoholic extract could improve common conditions of the ratsw ith collagen-induced arthritis early,relieve swollen degreesof the joints,improve the symptom of synovitisand protect the joint,which reflects the advantagesof early treatmentof RA.