蛋白激酶Cα參與高糖致人系膜細胞癌胚纖維連接蛋白的表達

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蛋白激酶Cα參與高糖致人系膜細胞癌胚纖維連接蛋白的表達

杜超1，蔣智1，熊勤攀1，周波2

(1.岳池縣人民醫院內分泌科，四川岳池638300; 2.重慶醫科大學附屬第一醫院內分泌科，重慶400016 )

【摘要】目的:研究高糖環境下人系膜細胞(HMC)蛋白激酶Cα(protein kinase Cα，PKCα)、癌胚纖維連接蛋白(oncofetal FN)表達水平，并進一步探討PKCα與oncofetal FN mRNA之間的關系。方法:實驗HMC分組如下:正常葡萄糖組(NG，5 mmol/L D-葡萄糖)，滲透壓對照組(LG，5 mmol/L D-葡萄糖+ 20 mmol/L L-葡萄糖)，高葡萄糖組(HG，25 mmol/L D-葡萄糖)，高葡萄糖+ PKCα抑制劑組(HS，25 mmol/L D-葡萄糖+40 μmol/L Safingol)。以激光共聚焦顯微鏡觀察PKCα蛋白表達及轉位，RT-PCR法檢測oncofetal FN mRNA表達水平。結果: (1)與NG組對比，高葡萄糖可促進蛋白激酶Cα蛋白發生核轉位，定量分析示HG組胞漿/胞核強度較NG組降低20％(P＜0.05)，高葡萄糖刺激誘導HMC oncofetal FN mRNA上調，為NG組的2.36倍(P＜0.05)。(2)與HG組比較，HS組PKCα蛋白轉位激活被抑制，胞漿/胞核熒光強度比值為HG組的1.15倍，HS組oncofetal FN mRNA表達較HG組降低45％(P值均＜0.05)。結論: PKCα的激活參與高葡萄糖致人系膜細胞oncofetal FN的表達。

【關鍵詞】蛋白激酶Cα;癌胚纖維連接蛋白;高糖;系膜細胞

腎臟系糖尿病血管并發癥的主要靶器官之一，高糖可促進腎臟細胞外基質聚集，其中，纖維連接蛋白(FN)是構成細胞外基質的基本成分，癌胚纖維連接蛋白(oncofetal FN)被認為是新合成FN的重要標記［1-2］。高糖可誘導蛋白激酶Cα(PKCα)轉位激活，促進炎癥因子、氧化應激的產生而加重腎臟的損傷。然而，PKCα是否參與調節高糖環境下oncofetal FN的表達尚不清楚，因此，本實驗以體外培養人系膜細胞為模型，觀察高糖對系膜細胞PKCα和oncofetal FN表達的影響，并探討PKCα在其中的作用，以期為闡明糖尿病腎病發病機制和臨床防治提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1材料

HMC由重慶醫科大學基礎醫學研究所惠贈。D-葡萄糖購(Bio Basic公司)，RPMI 1640培養基(GIBCO公司)，PKCα特異性抑制劑Asfingol(sigma公司)，RT-PCR相關試劑盒(大連寶生物公司)，兔抗人PKCα多抗、TRITC標記山羊抗兔IgG(Santa Cruz公司)。PCR儀及凝膠成像系統(Bio-Rad公司)，激光共聚焦顯微鏡(MD公司)。

1.2人系膜細胞培養與分組

HMCs培養于RPMI 1640培養液中(37℃、5％ CO2)，分組如下: (1)正常葡萄糖組(NG，5 mmol/L D-葡萄糖)，(2)滲透壓對照組(LG，5 mmol/L D-葡萄糖+20 mmol/L L-葡萄糖)，(3)高葡萄糖組(HG，25 mmol/L D-葡萄糖)，(4)高葡萄糖+ PKCα抑制劑組(HS，25 mmol/L D-葡萄糖+ 40 μmol/L Safingol)，共培養2 d。

1.3激光共聚焦顯微鏡(LSCM)檢測PKCα蛋白表達及轉位

分組細胞經固定、打孔、封閉、孵育抗體、封片，激光共聚焦顯微鏡拍照，Image-Pro Plus 6.0軟件行熒光強度分析。具體方法參見本實驗室既往研究報道［3］。

1.4RT-PCR法檢測oncofetal FNmRNA表達

提取各組細胞總RNA，逆轉錄成cDNA，進一步PCR反應。oncofetal FN引物序列見參考文獻［3］，P1∶5'CCGCCATTAATGAGAGTGAT 3'，P2∶5' AGTTAGTTGCGGCAGGAGAAG 3'，產物長度133 bp，內參β-actin引物序列見參考文獻［3］，P1∶5'CCATGTACGTTGCTATCCAGG 3'，P2∶5' TCTCCTTAATGTCACGCACGA 3'，產物長度252 bp。PCR產物經4％瓊脂糖凝膠電泳后照相，Quantity One軟件分析圖像，以oncofetal FN與β-actin光密度值之比反應oncofetal FN的相對表達量。

1.5統計學分析

2　結果

2.1高糖對人系膜細胞PKCα表達的影響

LSCM觀察NG組PKCα主要分布于細胞質中，胞核表達弱，LG組與NG組相似，HG組胞質、胞核內均見熒光分布，且PKCα呈胞質向胞核轉位(圖1);定量分析示HG組細胞核平均熒光強度為NG組的1.32倍，胞質/胞核熒光強度比值較NG組下降20％ (P值均＜0.05，見表1)，提示高糖促進PKCα核轉位，而高滲透無此效應。

圖1　激光共聚焦顯微鏡觀察各組人系膜細胞細胞PKCα蛋白表達（×800）

2.2高糖對人系膜細胞oncofetal FN mRNA表達的影響

RT-PCR顯示NG組、LG組oncofetal FN條帶較淡，HG組條帶明亮，半定量顯示HG組oncofetal FN mRNA為NG組的2.36倍(P值＜0.05，見圖2，表2)。

圖2　各分組人系膜細胞癌胚型纖維連接蛋白（oncofetal FN mRNA）表達

2.3PKCα抑制劑對高糖作用下人系膜細胞onco-fetal FN mRNA表達的影響

與HG組比較，HS組PKCα胞核表達較弱，定量分析示胞質/胞核熒光強度比值較HG組增加15％(P值均＜0.05，見圖1，表1);與HG組比較，HS組oncofetal FN mRNA為HG組的55％ (P值＜0.05，見圖2，表2)。

表1　各組人系膜細胞MR平均熒光強度(±s，n =3)

表1　各組人系膜細胞MR平均熒光強度(±s，n =3)

* P＜0.05，與NG組比較; #P＜0.05，與HG組比較。

組別　　胞質　　胞核　　胞質/胞核NG組29.657±4.256　12.086±1.861　2.454±0.126 LG組　30.482±2.854　12.847±1.569　2.373±0.164 HG組　31.581±3.763　16.026±1.824*　1.971±0.098*HS組　30.495±4.328　13.429±1.456#　2.271±0.114#

表2　各組人系膜細胞oncoFNmRNA表達水平(±s)

表2　各組人系膜細胞oncoFNmRNA表達水平(±s)

* P＜0.05，與NG組比較; #P＜0.05，與HG組比較。

組別　oncofetal FNmRNA 相對表達量NG組0.247±0.012 LG組　0.253±0.011 HG組　0.584±0.042*HS組　0.321±0.016#

3　討論

蛋白激酶C是一類Ca2 +和磷脂依賴性蛋白，具有多種亞型，其在細胞信號轉導中扮演重要角色［4-5］。研究表明，高血糖可激活蛋白激酶C而促進糖尿病腎病的發生及發展［6-7］。PKCα是蛋白激酶C的亞型之一，廣泛存在于腎臟系膜細胞、內皮細胞、上皮細胞中，在本實驗中，PKCα在正常葡萄糖濃度時主要分布在系膜細胞胞漿內，胞核表達很少，在高濃度葡萄糖時胞核表達增強，胞漿減弱，表明PKCα在高糖環境存在核轉位激活效應，此與萬沁等［8］學者的研究結果一致，進入胞核的PKCα可增加細胞外基質的聚集而介導糖尿病腎病的發生及發展［9］。

oncofetal FN現被認為是反映新合成細胞外基質的主要標記，研究表明高糖環境誘導視網膜內皮細胞oncofetal FN的表達上調［10］，而本課題組既往的研究表明高糖增加系膜細胞oncofetal FN的表達水平［3，11］，本次研究再次證實上述結果，此與Khan等［12］的研究結果相似。高糖可通過上調轉化生長因子-β(TGF-β)和結締組織生長因子的表達誘導纖維連接蛋白的合成而促進細胞外基質的聚集，肖瑛等［9］研究進一步證實PKCα參與調節這一效應。然而，高糖環境下PKCα與oncofetal FN之間的關系尚無相關研究。本研究通過采用PKCα特異性抑制劑，觀察到阻斷PKCα轉位激活效應可影響高糖環境下oncofetal FN表達水平，但具體作用機制不清，可能系PKCα抑制TGF-β表達，從而下調oncofetal FN表達水平有關［13］，尚需進一步研究證實。

本研究通過在體外建立高糖環境對人系膜細胞的損傷模型，證實高糖誘導系膜細胞PKCα轉位激活效應，并增加系膜細胞oncofetal FN mRNA的表達，而PKCα抑制劑顯著降低高糖對系膜細胞oncofetal FN mRNA的作用。表明PKCα可能參與調節高糖下系膜細胞oncofetal FN的表達，進而影響細胞外基質聚集，其為糖尿病腎病的發病機制及臨床防治提供一定的理論依據。

參考文獻

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(學術編輯:蒲素)

網絡出版時間: 2015-3-5 12∶47網絡出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20150305.1247.010.html

Effect of protein kinase Cα on the expression of oncofetal FN in human mesangial cells by high glucose

DU Chao1，JIANG Zhi1，XIONG Qin-pan1，ZHOU Bo2

(1.Department of Endocrinology，The People’s Hosptial of Yuechi，Yuechi 638300，Sichuan; 2.Department of Endocrinology，The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，Chongqing，China)

【Abstract】Objective: To investigate the level of protein kinase Cα(PKCa)，oncofetal fibronectin (oncofetal FN)in human mesangial cells(HMCs)exposed to high glucose，and explore the relationships of PKCa with expression of oncofetal FN mRNA.Methods: HMCs were divided into the following groups: normal glucose group(NG，D-glucose 5 mmol/L)，osmotic control group(LG，D-glucose 5 mmol/L + L-glucose 20 mmol/L)，high glucose group(HG，D-glucose 25 mmol/L)，and high glucose + Safingol group(HS，D-glucose 25 mmol /L + Safingol 40 μmol /L).The expression and translocation of PKCa protein was observed by confocal laser scanning microscopy，The mRNA expression of oncofetal FN were detected by RT-PCR.Results: (1)High glucose induced PKCa translocation from cytosol to nucleus，and quantitative analysis showed the ratio of plasma/nuclear fluorescence intensity in HG group decreased 20％ compared with NG group (P＜0.05).Oncofetal FN mRNA in HG group was up-regulated，with 2.36 folds of NG group(P＜0.05).(2)Compared with HG group，the activation of PKCa in group HS was inhibited and the ratio of plasma/nuclear fluorescence intensity increased 15％.Besides，the mRNA expression of oncofetal FN in group HS was 45％ down-regulated compared with group HG (both P＜0.05).Conclusion: High glucose increase the expression of oncofetal FN in HMCs，which related to the activation of PKCa.

【Key words】Protein kinase Cα; Oncofetal fibronectin; High glucose; Mesangial cells

通訊作者:蔣智，E-mail:9395286@qq.com

作者簡介:杜超(1982-)，男，四川廣安人，碩士，主治醫師，主要從事糖尿病微血管并發癥防治研究。

基金項目:國家自然科學基金(81370940)

收稿日期:2014-06-28

doi:10.3969/j.issn.1005-3697.2015.01.10

【文章編號】1005-3697(2015)01-0043-04

【中圖分類號】R692.9

【文獻標志碼】A