真武膠囊安全性評價研究*

申 安，袁 洋，岳園園，張 穎，李曉天，張玉靜

(1.焦作市食品藥品檢驗所，河南 焦作 454001； 2.大連醫(yī)科大學附屬第一人民醫(yī)院，遼寧 大連 116000； 3.鄭州大學藥學院，河南 鄭州 450000)

真武膠囊安全性評價研究*

申 安1，袁 洋2，岳園園3，張 穎3，李曉天3，張玉靜3

(1.焦作市食品藥品檢驗所，河南 焦作 454001； 2.大連醫(yī)科大學附屬第一人民醫(yī)院，遼寧 大連 116000； 3.鄭州大學藥學院，河南 鄭州 450000)

目的：對真武膠囊的安全性進行研究。方法：取40只KM小鼠進行急性毒性試驗。將小鼠隨機分為對照組和真武膠囊組2組，每組20只。真武膠囊組給予真武膠囊生藥粉57.14g/(kg·d)，對照組給予羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)0.4 g /(kg·d)，灌胃給藥，1d 2次，上、下午各1次，給藥間隔約為6 h，給藥期限為1 d。給藥后觀察動物反應，連續(xù)觀察15 d。另取SD大鼠160只進行長期毒性試驗。將大鼠隨機分為對照組(CMC-Na 0.05 g/kg)，真武膠囊低劑量(1.71g/kg)、中劑量(3.20 g/kg)、高劑量(5.97 g/kg)組4組，灌胃給藥，1 d 1次，每周給藥6 d，連續(xù)給藥90 d。觀察一般狀況，并檢測血液學指標、血液生化學指標，對心臟、氣管、肺和胃組織進行病理學檢查。結(jié)果：急性毒性試驗中所有動物均未出現(xiàn)明顯的毒性反應，觀察期結(jié)束后對全部動物進行剖檢，肉眼觀察各臟器無明顯異常。長期毒性試驗在給藥后的觀察期內(nèi)實驗動物一般狀況良好，血液學指標、各臟器組織等均未出現(xiàn)與藥物相關(guān)的毒性反應。結(jié)論：真武膠囊具有較好的安全性。

真武膠囊/藥效學；安全性；毒性試驗；動物模型；小鼠

真武湯出自《傷寒論》,由附子、生姜、茯苓、白術(shù)、白芍組成，是為表證過汗傷陽、少陰病陽虛水泛病證而設(shè)的名方[1]。本研究采用新的配方比例首次將真武湯改為膠囊劑型，按照《藥品注冊管理辦法》新藥技術(shù)要求，對真武膠囊做臨床前安全性評價。

1 材 料

1.1 動 物

急性毒性試驗用動物：經(jīng)檢疫合格的SPF級KM小鼠40只，雌雄各半,雄性體質(zhì)量18.8～24.6g，雌性體質(zhì)量18.0～22.5 g，由河南省實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(豫)2010-0002，實驗動物質(zhì)量合格證號為1019164。長期毒性試驗用動物：經(jīng)檢疫合格的SPF級SD大鼠160只，雌雄各半，雄性體質(zhì)量112.0～141.3g，雌性體質(zhì)量122.5～153.7g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(京)2012-0001，實驗動物質(zhì)量合格證號11400700022526。

1.2 藥品與試劑

真武膠囊，每粒膠囊含0.4 g膠囊粉，每克膠囊粉相當于8.75 g生藥，由某制藥股份有限公司提供，批號130506。羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，由國藥集團化學試劑有限公司提供，批號F20090113。

2 方法與結(jié)果

2.1 急性毒性試驗

2.1.1 動物分組與給藥

將40只KM小鼠隨機分為對照組和真武膠囊組2組，每組20只，雌雄各半。真武膠囊組給予真武膠囊生藥粉57.14 g/(kg·d)，對照組給予CMC-Na 0.4 g /(kg·d)，均灌胃給藥，1 d 2次，上、下午各1次，給藥間隔約為6 h ，給藥期限為1 d。

2.1.2 檢測指標

觀察給藥后動物的一般狀況，稱量體質(zhì)量，記錄動物中毒的表現(xiàn)和特點、毒性反應出現(xiàn)和消失時間，以及動物的死亡時間，并連續(xù)觀察15 d。

2.1.3 結(jié) 果

在給藥后的觀察期內(nèi)，所有動物均未出現(xiàn)明顯的毒性反應，動物無一例死亡。真武膠囊組動物的體質(zhì)量與對照組對比，差別無統(tǒng)計學意義。觀察期結(jié)束后對全部動物進行剖檢，肉眼觀察各臟器無明顯異常。

2.2 長期毒性試驗

2.2.1 動物分組與給藥

將160只SPF級SD大鼠，隨機分為對照組(CMC-Na 0.05 g/kg)、真武膠囊低劑量(1.71 g/kg)、中劑量(3.20 g/kg)、高劑量(5.97 g/kg)組4組，每組40只，雌雄各半[2]。均灌胃給藥，1 d 1次，每周給藥6 d，連續(xù)給藥90 d。

2.2.2 檢測指標

每天進行一般狀況觀察，每周稱量2次體質(zhì)量，并于給藥90 d時進行血液學、血清生化學以及病理學檢查。病理檢查根據(jù)鏡檢記錄進行分析[3-5]。

2.2.3 統(tǒng)計學方法

2.2.4 結(jié) 果

一般狀況及體質(zhì)量：各用藥組大鼠的一般狀況良好，未見明顯與藥物相關(guān)的毒性癥狀。各用藥組大鼠的體質(zhì)量與對照組對比，差別無統(tǒng)計學意義。

給藥90 d時各組雄性大鼠血液學指標對比：與對照組對比，真武膠囊粉高劑量組RBC水平降低(P<0.01)、HGB水平降低(P<0.05)、PLT增高(P<0.05)，真武膠囊粉中劑量組RBC水平降低(P<0.05)，但以上指標均在正常值范圍內(nèi)，且未見與給藥劑量及進程的相關(guān)性。各用藥組其余指標與對照組比較差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

組 別劑量/(g·kg-1·d-1)RBC/(1012·L-1)HGB/(g·L-1)PLT/(109·L-1)WBC/(109·L-1)NEU/%LYM/%對照組0.0512.25±1.90174.10±25.04678.30±322.177.06±3.6117.018±5.2863.59±12.65真武膠囊高劑量組52.210.37±1.07**153.44±8.83*965.11±134.77*5.23±1.3215.66±3.7663.38±12.72真武膠囊中劑量組28.011.52±1.31*166.30±17.71922.00±323.555.40±2.1418.02±5.5766.04±11.83真武膠囊低劑量組15.011.92±0.89165.60±12.61832.50±251.437.98±3.0414.94±4.3172.86±7.39

注：與對照組對比，*P<0.05，**P<0.01。

給藥90 d時各組雄性大鼠血清生化學指標對比：與對照組對比，真武膠囊粉高劑量組TP升高(P<0.05)，但在正常值范圍內(nèi)，且未見與給藥劑量及進程的相關(guān)性。各用藥組其余指標與對照組比較(P>0.05)。見表2。

組 別劑量/(g·kg-1·d-1)ALT/(U·L-1)AST/(U·L-1)ALP/(U·L-1)GGT/(U·L-1)TP/(g·L-1)ALB/(g·L-1)TBiL/(mmol·L-1)對照組0.0545.44±8.01112.60±19.4996.69±37.291.17±0.3069.78±4.3633.41±3.804.64±0.51真武膠囊高劑量組52.242.64±4.39107.50±22.44105.92±14.401.08±0.2665.53±5.97*31.31±4.124.27±0.55真武膠囊中劑量組28.041.73±4.19108.10±15.07102.00±14.251.15±0.3168.23±1.1632.58±2.634.63±0.48真武膠囊低劑量組15.043.96±7.45105.70±15.87108.38±7.571.19±0.3170.21±5.2032.82±3.984.47±0.50

注：與對照組對比，*P<0.05。

給藥90 d時各組雌性大鼠血液學指標對比：與對照組對比，真武膠囊粉高劑量組RBC水平降低(P<0.05)，HGB水平降低(P<0.05)，但二者均在正常值范圍內(nèi)，且未見與給藥劑量及進程的相關(guān)性。各用藥組其余指標與對照組比較(P>0.05)。見表3。

組 別劑量/(g·kg-1·d-1)RBC/(1012·L-1)HGB/(g·L-1)PLT/(109·L-1)WBC/(109·L-1)NEU/%LYM/%對照組0.0510.14±1.96150.30±23.76900.70±240.833.88±1.2415.92±5.7573.08±9.25真武膠囊高劑量組52.29.14±1.06*138.20±12.74*995.90±154.713.63±1.7515.03±3.7876.85±6.02真武膠囊中劑量組28.09.56±1.25145.00±17.51854.60±240.073.67±1.3819.44±5.9370.36±8.36真武膠囊低劑量組15.09.32±2.45138.30±35.38895.10±315.524.33±2.7114.58±5.8870.05±9.05

注：與對照組對比，*P<0.05。

給藥90 d時各組雌性大鼠血清生化學指標對比：與對照組對比，真武膠囊粉高劑量TP升高(P<0.05)，但在正常值范圍內(nèi)，且未見與給藥劑量及進程的相關(guān)性。各用藥組其余指標與對照組比較差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

組 別劑量/(g·kg-1·d-1)ALT/(U·L-1)AST/(U·L-1)ALP/(U·L-1)GGT/(U·L-1)TP/(g·L-1)ALB/(g·L-1)TBiL/(mmol·L-1)對照組0.0543.1±5.70102.70±9.18103.10±14.421.22±0.2869.41±3.5332.94±2.484.43±0.60真武膠囊高劑量組52.245.69±3.76106.40±10.54110.57±12.841.34±0.2765.07±5.25*32.76±3.653.88±0.62真武膠囊中劑量組28.045.00±5.92107.80±9.52105.23±15.411.17±0.2469.08±4.8832.27±3.444.31±0.37真武膠囊低劑量組15.043.92±4.61101.92±9.55104.46±11.461.31±0.2375.37±8.4633.57±2.494.45±0.77

注：與對照組TP對比,真武膠囊高劑量組 *P<0.05。

病理檢查結(jié)果：動物組織器官未出現(xiàn)與藥物相關(guān)的毒性反應，高劑量組大鼠心臟、氣管、肺和胃的病理切片見圖1～4。大鼠心肌纖維條紋清晰，無變性、壞死。氣管黏膜、黏膜下層和外膜結(jié)構(gòu)清楚。肺終末支氣管與肺泡組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁與肺泡腔內(nèi)均無炎性細胞浸潤。胃黏膜皺襞清楚，被覆上皮完整，未見潰瘍、增生等改變。

圖1 心臟的病理切片(HE染色，×40)

圖2 氣管的病理切片(HE染色，×10)

圖3 肺的病理切片(HE染色，×20)

圖4 胃的病理切片(HE染色，×10)

3 討 論

真武膠囊是在傳統(tǒng)真武湯(由附子、生姜、茯苓、白術(shù)、白芍組成)的基礎(chǔ)上，進一步完善藥物組方、改變劑型而研制出的藥物，與真武湯的治療作用一致，但較真武湯有服用方便、藥物穩(wěn)定性好等優(yōu)點。為了預測受試物可能引起的臨床不良反應，為臨床試驗中解毒或解救措施提供參考，筆者進行了急性毒性試驗和長期毒性試驗。急性毒性試驗所獲得的信息對重復給藥毒性試驗的劑量設(shè)計和藥物臨床試驗起始劑量的選擇具有重要參考價值，并對了解其毒性靶器官和初步闡明藥物的毒性作用具有重要意義。在本實驗條件下，一天內(nèi)灌胃給予小鼠57.14 g /kg真武膠囊生藥粉(相當于擬用臨床劑量的104.1倍)，所有動物均未發(fā)現(xiàn)明顯的毒性反應。長期毒性試驗可以用來推測第一次臨床試驗的起始劑量，為后續(xù)臨床試驗提供安全劑量范圍以及為臨床不良反應監(jiān)測及防治提供參考。本實驗條件下，用真武膠囊粉給SD大鼠連續(xù)灌胃90 d，高劑量相當于真武膠囊生藥粉52.2 g/(kg·d) ，相當于臨床用量的85.3倍，各項檢測指標均未出現(xiàn)明顯的劑量及時間依賴性。

本研究結(jié)果顯示：真武膠囊組動物均未發(fā)現(xiàn)明顯的毒性反應，各項血液學和血清生化學指標變化也未見明顯劑量及時間依賴性，各組織器官未發(fā)現(xiàn)異常。表明真武膠囊具有良好的安全性，但其具體臨床安全性還有待于進一步研究。

[1]王均寧,劉更生.真武湯的藥理研究與臨床應用[J].中成藥，1998,20(11):45-46.

[2]國家藥品監(jiān)督管理局.藥物重復給藥毒性試驗技術(shù)指導原則[S].北京：國家食品藥品監(jiān)督管理總局藥品評審中心，2014：53-59.

[3]袁伯俊, 廖明陽, 李波.藥物毒理學試驗方法與技術(shù)[M].北京:化學工業(yè)出版社, 2007.

[4]孫勁,徐元宏.SD大鼠常見血液學檢測指標參考范圍的建立[J].臨床輸血與檢驗,2008,10(3):253-255.

[5]鄧雯,陳莉莉,劉晶,等.SPF級SD大鼠血液學及血清生化指標正常值探討[J].毒理學雜志,2010,24(2):174-175.

(編輯 陶 珠)

1001-6910(2015)08-0061-04 ·實驗研究·

R286

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.08.30

李曉天，教授，博士后，lixt@zzu.edu.cn

河南省科技攻關(guān)項目(13210231241)

2015-04-22；

2015-06-23