外周血單個核細胞Notch1水平與穩定性心絞痛患者側支循環形成的關系

羅儀山,劉 震,陳璐珊,陳平安,潘藝朝,李韶南

(廣州市第一人民醫院 1.急診科,廣東 廣州 510180;2.心內科)

冠狀動脈側支循環(CCC)形成良好與否是影響冠心病患者臨床表現和預后的重要因素之一[1],冠心病患者CCC形成存在較大的個體差異,冠狀動脈病變嚴重程度、心肌缺血時間、基礎疾病均有可能影響CCC的形成。研究發現Notch信號通路對血管的發生發展,包括細胞增殖、遷移、平滑肌分化、血管生成、動靜脈分化等多個方面有重要調控功能[2]。本研究探討冠狀動脈存在嚴重狹窄的穩定性心絞痛(SAP)患者Notch1對CCC形成的影響及相應機制。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2018～2019年廣州市第一人民醫院心內科收治并接受冠狀動脈造影檢查(CAG)證實左前降支、回旋支、右冠狀動脈3支主要冠狀動脈至少1支血管存在≥90%狹窄的SAP患者100例,其中男53例,女47例,平均年齡(59.41±8.13)歲,SAP診斷標準符合2007年《中國慢性穩定性心絞痛診斷與治療指南》。另選取同期在本院體檢中心進行健康體檢的非冠心病人群50例作為對照組。入選的SAP患者住院期間都接受標準的冠心病二級預防藥物治療,包括阿司匹林0.1 g/d、氯吡格雷75 mg/d雙聯抗血小板,若無禁忌均使用他汀、β受體阻滯劑、血管緊張素轉換酶抑制物(ACEI)及血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)等藥物。排除標準:①近3個月內發生過急性心肌梗死;②既往接受過PCI或外科冠狀動脈旁路移植術(CABG)治療;③嚴重肝腎功能不全、重癥感染、血液系統或自身免疫疾病、惡性腫瘤;④合并嚴重瓣膜性心臟病或先天性心臟病者。本次研究經過本院醫學倫理委員會同意。

1.2方法

1.2.1CAG和CCC分級:Seldinger法穿刺橈動脈或股動脈為入路行選擇性CAG,CAG在Philips Allura xper FD20 數字減影血管造影X線機上進行,常規體位投照,必要時加照其他的特殊體位。采集3～5個以上的心動周期影像,以觀察清楚并確認CCC,CCC的確認及分級由2位經驗豐富的心血管介入醫師評判。采用Rentrop分級方法對CCC進行分級[3]:0級為無側支形成;1級為病變遠端分支顯影;2級為病變遠端血管部分顯影;3級為病變遠端血管完全顯影[4]。將入選SAP患者分為CCC不良組(Rentrop分級0～1級)44例和CCC良好組(Rentrop分級2～3級)56例。

1.2.2血液學標本的收集、生化指標、外周血單個核細胞和血管內皮細胞生長因子(VEGF)的檢測:①清晨采取隔夜空腹外周靜脈血4 ml,放入4 ℃冰箱保存,使用美國Beckman-Coulter LX20 全自動生化分析儀,電化學方法檢測患者肝功能、血肌酐、空腹血糖(FBG)、高敏C-反應蛋白(hs-CRP)、低密度脂蛋白(LDL-C)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)等。②患者外周血單個核細胞Notch1表達水平的檢測[5]:主要試劑包括Trizol總RNA提取液(GibcoBRL公司,德國),TaqDNA聚合酶(申友公司,上海),反轉錄M-MLV(Promega 德國),Tap-TM試劑盒(Applied Biosystems公司,美國)。檢測步驟:根據基因庫中人Notch1和選作內參的人β-actin的mRNA序列,Primer premier2.0軟件設計引物;外周血單個核細胞總RNA提取及逆轉錄: 取3 ml外周靜脈血,等體積生理鹽水稀釋,5 ml淋巴細胞分離液分離單個核細胞,離心30 min收集單個核細胞層,加入PBS緩沖液離心10 min洗滌細胞2次,收集細胞沉淀,按照RNA提取試劑盒說明書提取總RNA,采用TaqMan逆轉錄試劑盒將提取的總RNA逆轉錄為cDNA;實時熒光定量PCR(RFQ-PCR)檢測Notch1基因表達[5],以逆轉錄的cDNA為模板,采用TaqTM試劑盒進行PCR反應,總反應體積20 μl,按試劑盒說明書操作,定義△Ct=目的基因(Notch1)Ct-內參(β-actin)Ct;△△Ct=待測樣品中目的基因(Notch1)△Ct-參照樣品中目的基因(Notch1)△Ct,相對樣品模板量RQ=2-△△Ct(*注解:Ct值的含義:每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數)。以相對樣本模板量表示單個核細胞Notch1的相對表達量。③VEGF水平的測定:患者均于入院后第2日清晨空腹抽取靜脈血2 ml,健康對照組于體檢當天上午8∶00空腹狀態下留取靜脈血標本,放入血清分離管中室溫凝固30 min,2 000 r/min離心10 min(離心半徑為20 cm),將血清轉至EP管-20 ℃保存,采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測人血清VEGF濃度[4]。

1.3統計學方法:應用SPSS22.0 統計軟件進行采用χ2及t檢驗及單因素方差分析Pearson相關分析;采用多因素Logistic回歸分析評價循環外周血單個核細胞Notch1相對表達量及血清VEGF水平對SAP患者CCC形成良好的預測意義。

2 結果

2.1三組一般資料比較:CCC良好組和CCC不良組在臨床基線資料比較差異無統計學意義(P>0.05)。與對照組相比,SAP患者中合并高血壓、糖尿病及心功能NYHA>2級的比例較高,hs-CRP水平升高。見表1。

表1 三組一般資料比較

2.2三組外周血單個核細胞Notch1水平和血清VEGF水平比較:與對照組比較,CCC不良組及CCC良好組患者外周血單個核細胞Notch1水平、血清VEGF水平的明顯升高,差異有統計學意義(P<0.05);與CCC不良組比較,CCC良好組患者外周血單個核細胞Notch1水平、血清VEGF水平的明顯升高,差異有統計學意義(P<0.01)。見表2。

表2 三組Nothch1與VEGF水平的比較

2.3外周血單個核細胞Notch1水平對冠脈嚴重狹窄的SAP患者側支循環形成良好的預測意義:以CCC為應變量(CCC良好為1;不良為0),以年齡、性別、吸煙、高血壓、糖尿病、腎功能不全、LDL-C、高密度脂蛋白(HDL-C)、hs-CRP、同型半胱氨酸(Hcy)、N末端腦利尿鈉肽前體(NT-proBNP)、FBG、外周血單個核細胞Notch1相對表達量、血清VEGF水平等作為因變量進行多因素Logistic回歸分析,顯示hs-CRP、VEGF、外周血單個核細胞Notch1相對表達量為CCC形成的獨立預測影響因素。見表3。

表3 Notch1、VEGF對CCC的預測意義

2.4SAP患者外周血單個核細胞Notch1相對表達量與血清VEGF水平之間的關系:采用Pearson相關分析分別對CCC良好組及CCC不良組SAP患者外周血單個核細胞Notch1相對表達量與血清VEGF水平的相關性進行分析,結果顯示在CCC良好組患者中,兩者的水平呈顯著正相關(r=0.637,P<0.05);而在CCC不良組患者中,兩者無顯著相關性(r=0.201,P>0.05)。

3 討論

研究表明,CCC充分建立的冠心病患者死亡風險下降36%[6],良好的CCC可以代償性地提供血液,從而保護左室功能、縮小梗死面積、減少惡性心律失常等不良心臟事件,是冠狀動脈循環的重要儲備和保護機制[7]。但目前CCC需經過CAG才能發現,缺乏無創手段檢查及判斷CAD患者CCC的情況。

本研究發現在冠狀動脈嚴重狹窄的SAP患者中,CCC良好組患者外周血單個核細胞Notch1相對表達量及血清VEGF水平均顯著高于CCC不良組及對照組。Notch信號通路是一個高度保守的信號轉導通路,具有調節細胞的增殖、分化以及凋亡的作用。研究顯示,在血管內皮、平滑肌細胞均存在不同程度的Notch家族基因表達,其成員相互作用,在細胞增殖、分化等諸多方面起重要調控作用[8]。其中Notch1主要負責血管新生及血管合理發展,而其配體DLL4協調血管出芽過程中端細胞和柄細胞的比例,調節血管形成。Dill等[7]發現Notch1信號通路可通過調控肝血竇內皮細胞的穩態,調節內皮細胞的異常分化,影響肝腫瘤新生血管的發生。VEGF是目前發現的作用最強、特異性最高的血管生長因子之一,VEGF通過與受體結合,活化下游信號轉導途徑,釋放各種生長因子和細胞因子,促進內皮細胞的遷移、增殖、生存,同時促使蛋白水解酶、間質膠原酶等過表達來降解基底膜和基質,從而誘導成纖維細胞分泌細胞外基質,最終形成新的血管。Clayton等[9]報道,通過反義核苷酸阻斷VEGF信號通路后可以使血管新生的數目顯著減少。而有研究在豬的冠心病模型中,通過冠狀動脈及心肌注射VEGF后可見缺血心肌的CCC明顯改善。

本研究結果顯示外周血單個核細胞Notch1及血清VEGF水平均是SAP患者CCC形成良好的預測因素,Pearson相關分析也顯示CCC良好組SAP患者外周血單個核細胞Notch1相對表達量與血清VEGF水平呈正相關,而CCC不良組SAP患者則無明顯相關。上述研究結果提示Notch1/VEGF通路與冠心病患者CCC形成有密切的關系。在腫瘤的研究發現Notch1信號可調節腫瘤內皮細胞VEGF的活性,影響其配體的表達進而調控血管出芽和血管側支的數量,促使血管新生及保證形成的血管具有完善的功能[10]。阻斷Notch1與其配體DLL4結合后可使VEGF表達減少,腫瘤組織內皮細胞失去刺激因子,不能誘導出芽,不能形成新的血管降低腫瘤的生長速度。在血管新生的體外試驗研究亦發現[11],Notch1通過其配體DLL4激活VEGF,活化的VEGF可使血管芽及血管網延長,增加血管側支的數量。

綜上所述,冠心病患者外周血單個核細胞Notch1可作為判斷和預測CCC形成的一種重要的血液標記物,Notch1信號通路調控VEGF表達可能是影響冠心病患者CCC的重要機制之一。但本研究仍存在樣本量偏小,研究的冠心病患者人群僅限于單一冠脈嚴重狹窄的穩定性冠心病患者,缺乏對急性冠脈綜合征這一高危冠心病人群CCC的研究和分析,其研究結果和結論有待將來大規模的臨床試驗進一步驗證。