血清、尿液TWEAK對狼瘡性腎炎活動性的預測及其機制研究

張 培，吳永貴，盧 敏

◇臨床醫學研究◇

血清、尿液TWEAK對狼瘡性腎炎活動性的預測及其機制研究

張 培1，吳永貴1，盧 敏2

目的探討腫瘤壞死因子樣凋亡微弱誘導劑（TWEAK）在狼瘡性腎炎（LN）患者血清、尿液及腎臟的表達以及與疾病活動的相關性及其免疫機制。方法ELISA法檢測LN患者及正常對照者血清、尿液中TWEAK、單核細胞趨化因子（MCP-1）水平，免疫組化法檢測LN患者以及正常對照者腎臟組織中的TWEAK水平，建立細胞遷移模型，觀察TWEAK對巨噬細胞遷移的影響。結果與正常對照者比較，LN患者血清以及尿液中的TWEAK、MCP-1均升高（P ＜0.01）。血清中TWEAK與系統性紅斑狼瘡疾病活動指數（SLEDAI）評分呈正相關性（r＝0.785，P＜0.01），與補體C3呈負相關性（r＝－0.552，P＜0.01）；尿液中TWEAK與SLEDAI評分呈正相關性（r＝0.853，P＜0.05），與補體C3呈負相關性（r＝－0.594，P＜0.01）。正常對照者腎臟的小管上皮細胞可見TWEAK表達，腎小球很少見表達；但在LN患者可見腎小管中明顯增強，腎小球表達增加，其腎內的TWEAK的表達水平較正常對照者上升（P＜0.05），Ⅳ型尤為顯著（P ＜0.05）。TWEAK可以誘導巨噬細胞遷移增加，可能參與LN病理進展。結論LN活動期患者血清、尿液、腎組織中TWEAK均表達增加，與臨床SLEDAI及炎癥因子MCP-1呈正相關性；TWEAK可作為預測LN活動性的有效無創臨床指標，并可能成為治療的靶點。

狼瘡性腎炎；TWEAK；MCP-1；細胞遷移

系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是多因素引起的機體免疫失調而產生一系列自身抗體所致的自身免疫性疾病，腎臟是SLE侵襲的主要器官之一，腎臟受累后引起的腎小球腎炎稱為狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN），LN的病理學改變多樣而多變，發病機制錯綜復雜。如何有效評價LN的活動性，給予對癥治療對于判斷患者生存及預后極其重要。腎穿刺活檢病理檢查是診斷LN及評判疾病活動性的金標準，但因其存在創傷性及患者條件限制使其不能廣泛應用及反復進行。因此尋找評價LN活動性相關的臨床指標尤為重要。腫瘤壞死因子樣凋亡微弱誘導劑（tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis，TWEAK）是腫瘤壞死因子配體超家族的新成員，TWEAK以膜結合蛋白形式合成后迅速分解為小的可溶性片段［1］，與其受體人成纖維細胞生長因子誘導14（Fn14）相結合，具有誘導炎癥反應、刺激凋亡及激活細胞增生等多種生物學活性。Zhao et al［2］對TWEAK Fn14軸在慢性移植物抗宿主的SLE鼠模型研究表明Fn14基因敲除鼠的腎疾病嚴重程度顯著降低，表現為腎臟免疫球蛋白G沉積，吞噬細胞浸潤以及白介素-1、單核趨化因子-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）、調節活化正常T細胞表達與分泌的趨化因子和干擾素誘導蛋白-10等細胞因子均明顯減少。同樣，用抗TWEAK中和抗體處理也顯示腎臟白介素-6、白介素-10，MCP-1和蛋白尿減少。該實驗擬觀察TWEAK在腎組織中的表達，血清、尿液TWEAK水平與疾病活動性的相關性，并進一步闡明可能的機制。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集2012年3月～2013年3月于安徽醫科大學第一附屬醫院腎臟內科住院LN患者74例，其中男36例，女38例；年齡14～59（33.34 ±11.7）歲。SLE患者均符合2009年美國風濕病學會修訂的SLE分類標準。LN診斷標準：確診為SLE的患者，伴有持續性蛋白尿（24 h尿蛋白＞0.5 g）或管型（可為紅細胞、白細胞、顆粒管型或混合型）或經腎活檢病理證實為LN。41例患者接受腎臟組織活檢，病理為LN（Ⅲ型7例，Ⅳ型26例，Ⅴ型8例）。正常對照組血清及尿液選擇14例門診健康體檢者（無高血壓、糖尿病等慢性基礎疾病，且各項生化指標正常、自身抗體檢測陰性），其中男2例，女12例；年齡18～35（26.35±5.24）歲；病理標本選取本院泌尿外科10例腎腫瘤切除患者距離腫瘤部位至少2 cm的腎臟組織。本研究符合安徽醫科大學第一附屬醫院倫理委員會要求，參加研究患者均簽署同意書。

1.2 臨床資料及相關指標的收集①研究對象均進行血尿常規、肝腎功能、抗核抗體、抗-dsDNA和免疫球蛋白及補體成分C3、C4、血沉檢測?？购丝贵w和抗-dsDNA半定量檢測采用間接免疫熒光法，試劑盒購自德國歐蒙公司；自身抗體送安徽醫科大學第一附屬醫院風濕科實驗室檢測。根據臨床表現及實驗室檢查對患者進行SLE疾病活動指數（systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI）評分；②腎穿刺組織進行免疫熒光、HE、PAS、PASM、Masson染色，采用光鏡、免疫熒光顯微鏡對腎組織活檢標本進行觀察，參照2003年國際腎臟病協會／腎臟病理協會的病理分型標準對病理進行分型，用Austin半定量方法［3］對疾病活動性指數（activity index，AI）和慢性指數（chronic index，CI）進行判定。

1.3 ELISA法測定血清及尿液中TWEAK、MCP-1水平按照ELISA試劑盒說明書步驟進行操作，分別測定血清以及尿液中TWEAK、MCP-1水平。

1.4 免疫組化活檢測腎組織TWEAK水平石蠟標本經二甲苯脫蠟，下行酒精水化；分別采用微波、高壓抗原修復，滴加0.3%的H2O2溶液，滴加正常動物血清，過夜，滴加一抗，4℃過夜，然后滴加生物素化二抗，再滴加鏈霉親和素－生物素化過氧化物酶復合物，DAB顯色，蘇木精復染，脫水，封片。使用Image Pro-Plus 16.0圖像分析軟件對免疫組化圖像進行數據分析處理，以高倍鏡下累計光密度平均值代表該患者腎內TWEAK表達水平。

1.5 建立巨噬細胞遷移模型

1.5.1 原代血管內皮細胞體外分離及培養 將實驗小鼠脫臼處死，75%乙醇溶液浸泡10 min，打開胸腔找到主動脈，從兩頭剪下，去除動脈周圍組織，分離出完整主動脈，放在培養皿中剪成小組織塊，平鋪于培養皿中，約4 h后加4 ml培養基（低糖DMEM ＋10%胎牛血清），置于37℃、5%CO2培養箱中進行培養，隔天換液，約3～7 d細胞爬出，待細胞90%融合后傳代，第4代較純，可用于本實驗。

1.5.2 體外分離培養巨噬細胞 選擇雄性、6～8周齡大的GFP轉基因小鼠，連續3 d用1.5%的淀粉溶液腹腔注射，于第5天取腹腔巨噬細胞。具體步驟如下：①小鼠頸椎脫臼處死，75%乙醇溶液浸泡1 min；②用剪刀剪開小鼠外層腹膜；③注射器注射6 ml冷PBS溶液于小鼠腹腔并按摩小鼠腹部1 min；④注射器抽取腹腔灌洗液并注入5 ml EP管中；⑤腹腔灌洗液1 000 r／min離心4 min；⑥棄去

上清液并用3 ml冷PBS溶液重懸，并1 000 r／min離心4 min。反復用3 ml冷PBS溶液重懸離心3次；⑦將離心后的上清液棄去，加入3 ml的DMEM培養基重懸細胞，并種植于60 cm2的培養皿中；⑧10 min后，搖晃棄去未貼壁細胞，加入3 ml的DMEM培養基并用移液器將貼壁細胞吹打重懸，調整細胞濃度至1×106個／ml待用。

1.5.3 巨噬細胞遷移模型 Ⅳ型膠原蛋白鋪于帶有8 μm孔徑的插入式培養皿孵育24 h后，鋪上血管內皮細胞約4～5 d，待對照孔血管內皮細胞生長至100%融合即可。為了觀察TWEAK對巨噬細胞遷移的影響，本實驗分為兩組，兩組上室均加入含體積分數10%FBS的基礎培養基／鋪1 μgⅣ型膠原蛋白，并加入巨噬細胞懸液于上室，對照組：下室不加TWEAK；實驗組：下室添加TWEAK，48 h后，移去插入皿，收集下室細胞。計數下室細胞數，計算出TWEAK對單核細胞的遷移率。并用ELASA法檢測細胞培養上清液中細胞因子MCP-1水平。

1.6 統計學處理采用SPSS 19.0軟件進行分析，數據以±s表示。多組間比較采用One Way-ANOVA分析，兩組間數據比較采用獨立樣本t檢驗；采用Pearson法進行指標相關性分析。

2 結果

2.1 TWEAK、MCP-1在血清及尿液中的表達ELISA法檢測顯示LN患者血清及尿液TWAEK水平高于正常對照組（P＜0.05），見表1。方差分析顯示Ⅳ型、Ⅴ型LN患者的血清及尿液TWEAK水平差異有統計學意義（F＝156.85、68.38，P＜0.05）。ELISA法檢測LN組血清及尿液MCP-1水平高于正常對照組（P＜0.05），見表1。Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型LN患者的血清、尿液MCP-1水平差異有統計學意義（F ＝122.33、71.75，P＜0.05）。血清及尿液中MCP-1 與TWEAK水平呈相關性。

表1 LN患者與正常對照者血清及尿液TWEAK水平（μg／L，±s）

表1 LN患者與正常對照者血清及尿液TWEAK水平（μg／L，±s）

項目LN患者（n＝76）正常對照者（n＝14）t值血清TWEAK43.70±6.36*15.22±2.1919.76 MCP-10.17±0.01*0.07±0.0118.70尿液TWEAK47.71±12.54*17.27±2.2212.20 MCP-10.14±0.02*0.07±0.0114.04

2.2 TWEAK在腎組織中的表達正常對照者腎臟組織中TWEAK在腎小管上皮細胞可見較強的表達，但在腎小球表達極少；LN患者腎組織腎小管上皮細胞TWEAK表達明顯增加，腎小球中亦可見表達，見圖1。LN組較正常對照組表達增加（P＜0.05），方差分析顯示Ⅳ型LN患者的累積光密度值較Ⅲ型、Ⅴ型LN患者差異有統計學意義（F＝34.52，P＜0.05），但Ⅲ型、Ⅴ型之間差異無統計學意義。見圖1。

2.3 血清及尿液TWEAK與臨床指標相關性分析血清TWEAK水平與SLEDAI評分呈正相關性（r＝0.785，P＜0.01），與血MCP-1呈正相關性（r＝0.367，P＜0.01），與補體C3呈負相關性（r＝－0.552，P＜0.01），與AI呈正相關性（r＝0.634，P ＜0.01）。尿液TWEAK水平與SLEDAI評分呈正相關性（r＝0.853，P＜0.01），與補體C3呈負相關性（r＝－0.594，P＜0.01），與腎臟病理AI呈正相關性（r＝0.564，P＜0.01）。血清、尿液TWEAK水平與白細胞計數、血小板計數、血清IgG、IgA、IgM以及24 h尿蛋白等指標均無相關性。見圖2。

2.4 TWEAK對巨噬細胞遷移的影響為了確定培養體系中加入TWEAK對巨噬細胞的遷移有無影響，使用不加TWEAK的培養體系作為對照。然后實驗組加入TWEAK后和對照組一起放入培養箱中48 h后，評估巨噬細胞穿過PET膜的百分比（穿膜率），顯示巨噬細胞的穿膜率顯著高于對照組。見圖3。

3 討論

目前與LN活動性有關的許多新型生物標志物，均缺乏大規模的縱向隊列研究。未來研究方向著重于將SLE的生物標志物與簡便可行的臨床指標相結合，以提高腎臟病復發及進展預測的敏感性和特異性［3］。研究［4］顯示，與SLE腎臟未受累患者比較，LN標志物包括TWEAK、MCP-1及骨橋蛋白等均有升高，評估腎損害具有合理的敏感性及特異性，與SLEDAI評分呈正相關性。本實驗結果與之相符，是其更好的補充，本研究檢測表明LN患者血清中的TWEAK水平均較正常對照者明顯上升，血液TWEAK水平與SLEDAI呈正相關性，并且血清MCP-1水平明顯高于正常對照者，與疾病活動性呈正相關性，且血清TWEAK與MCP-1呈相關性。Liu et al［5］發現，LN患者外周血單個核細胞中TWEAK水平升高與抗-dsDNA、SLEDAI評分呈高度相關性，提示其與LN活動性高度相關。

TWEAK可促進腎臟炎癥細胞浸潤，在體內和體外環境中刺激腎細胞增殖。TWEAK通過Fn14相互作用引起前炎癥化學因子及細胞因子釋放，系膜細胞給予TWEAK治療可以引起IKB的磷酸化，此外還可引起細胞增殖存活［6－8］。如上所述TWEAK在促進炎癥反應、腎細胞增殖和凋亡及血管纖維化方面的調節功能，LN患者局部TWEAK表達增多，提示TWEAK可能在LN病理進展中發揮積極作用。本研究證實TWEAK在正常對照者腎小球很少見表達，腎小管可見有分布；但LN患者中腎小球及腎小管TWEAK的表達量較正常對照者均明顯增加；尤其是腎小球的表達顯著增強，Ⅳ型LN患者的表達量較Ⅲ型、Ⅴ型尤為升高，Ⅳ型LN表現為細胞彌漫增生，伴有新月體形成及毛細血管袢壞死，是LN最為嚴重的一種病理類型，也是臨床治療的難題。本研究顯示TWEAK過表達可以引起腎組織結構損傷，炎癥及細胞外基質增加。TWEAK過度表達與F4／80巨噬細胞浸潤相關，并且腎小管損傷的標志物及腎損傷分子顯著增加，提示TWEAK加重腎小管損傷。因此靶向抑制TWEAK通路可能會改善LN的細胞浸潤從而減少尿蛋白，需進一步實驗以證實。

LN的發病與腎小球內細胞增殖與凋亡平衡失調有關，即細胞大量增殖的同時，細胞凋亡相對不足，從而使細胞增殖占優勢［9］。這是一種增生型腎小球腎炎自我限制的細胞凋亡介導的調控過程［10］，LN患者機體中腎組織細胞平均增生指數明顯增高，同時細胞凋亡率也顯著增加，存在細胞凋亡過度，可能導致進行性腎小球硬化及出現腎小球固有細胞丟失、基質及纖維性成分增多的原因。Gao et al［11］對人腎臟系膜細胞、足細胞和腎小管上皮細胞進行研究，顯示TWEAK可誘導腎細胞表達多種炎癥介質包括RANTES、MCP-l、干擾素誘導蛋白-10、ICAM-I和血管細胞黏附分子等。這些細胞因子的產生均由活化的核轉錄因子κB介導，可被抗TWEAK單克隆抗體所抑制；TWEAK與其受體Fn14相互作用是慢性移植物抗宿主病狼瘡動物模型腎臟病理進展中最關鍵的步驟［12］。

TWEAK刺激的趨化因子可誘導人外周血單個核細胞，尤其是單核／吞噬細胞的遷移。綜上所述，TWEAK有可能在LN的發生機制以及病理變化中起著重要作用，為指導和判斷狼瘡活動程度提供幫助。本研究表明TWEAK可誘導巨噬細胞跨膜即遷移率增加，IV型LN表現為彌漫性細胞增生，因此TWEAK在Ⅳ型LN患者腎組織中表達最為明顯。鑒于腎臟穿刺的創傷和經濟壓力，聯合檢測血清、尿液TWEAK水平更為合適，尤其是尿液檢查作為一種無創性的方法，為臨床上判斷疾病復發與活動程度及指導治療提供依據，此外抑制TWEAK可能成為LN治療的新方向。

［1］ Chicheportiche Y，Bourdon P R，Xu H，et al.TWEAK，a new secreted ligand in the tumor necrosis factor family that weakly induces apoptosis［J］.J Biol Chem，1997，272（51）：32401－10.

［2］ Zhao Z，Burkly L C，Campbell S，et al.TWEAK／Fnl4 interactions are instrumental in the pathogenesis of nephritis in the chronic graft-versus-host model of systemic lupus erythematosus［J］.J Immunol，2007，179（11）：7949－58.

［3］ Mok C C.Biomarkers for lupus nephritis：a critical appraisal［J］.J Biomed Biotechnol，2010：638413.

［4］ El-Shehaby A，Darweesh H，El-Khatib M，et al.Correlations of urinary biomarkers，TNF-Like weak inducer of apoptosis（TWEAK），osteoprotegerin（OPG），monocytechemoattractantprotein-1 （MCP-1），and IL-8 with lupus nephritis［J］.J Clin Immuno l，2011，31（5）：848－56.

［5］ Liu Z C，Zhou Q L，Li X Z，et al.Elevation of human tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis in peripheral blood mononuclear cells is correlated with disease activity and lupus nephritis in patients with systemic lupus erythematosus［J］.Cytokine，2011，53（3）：295－300.

［6］ Campbell S，Burkly L C，Gao H X，et al.Proinflammatory effects of TWEAK／Fn14 interactions in glomerular mesangial cells［J］.J Immunol，2006，176（3）：1889－98.

［7］ Justo P，Sanz A B，Sanchez-Ni?o M D，et al.Cytokine cooperation in renal tubular cell injury：the role of TWEAK［J］.Kidney Int，2006，70（10）：1750－8.

［8］ Jakubowski A，Browning B，Lukashev M，et al.Dual role or TWEAK in angiogenic regulation［J］.J Cell Sci，2002，115（Pt 2）：267－74.

［9］ Mortensen E S，Fenton K A，Rekvig O P.Lupus nephritis：the central role of nucleosomes revealed［J］.Am J Pathol，2008，172 （2）：275－83.

［10］Tang S，Lui S L，Lai K N.Pathogenesis of lupus nephritis：an update［J］.Nephrology（Carlton），2005，10（2）：174－9.

［11］Gao H X，Campbell S R，Burkly I X，et al.TNF-like weal inducer of apoptosis（TWEAK）induces inflammatory and proliferative effects in human kidney cells［J］.Cytokine，2009，46（1）：24－35.

［12］Molano A，Lakhani P，Aran A，et al.TWEAK stimulation of kidney resident cells in the pathogenesis of graft versus host induced lupus nephritis［J］.Immunol Lett，2009，125（2）：119－28.

Association of serum and urine TWEAK with lupus nephritis activity and its underlying mechanism

Zhang Pei1，Wu Yonggui1，Lu Min2
（1Dept of Nephrology，2Dept of Laboratory，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo discuss the expression of tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis（TWEAK）in serum，urine and renal tissue in lupus nephritis（LN）.MethodsThe serum and urine levels of TWEAK were assessed by ELISA in LN patients and normal controls.Immunohistochemistry was used to detect the expressions of TWEAK in the kidney of patients and healthy controls.ResultsThe serum and urine concentrations of TWEAK and MCP-1 were significantly higher in LN patients than those in healthy controls（P＜0.01）.In addition，the level of serum TWEAK showed positive correlation with SLEDAI and negative correlation with serum C3 level（P＜0.01），the expression of urine TWEAK showed positive correlation with SLEDAI（P＜0.05）.In healthy renal tissues TWEAK was distributed mainly in renal tubules and rarely seen in glomerular while the expressions of TWEAK increased in renal tubular and glomeruli stainings were found in LN paitients.TWEAK could induce increased macrophage migration，may be involved in the pathological progression of lupus nephritis.ConclusionTWEAK may play key roles in the pathogenesis of LN.Meanwhile，TWEAK in serum and urine may be useful as markers of disease activity.The change of TWEAK maybe associated with the pathology category of LN.

lupus nephritis；TWEAK；MCP-1；cell immigration

R 593.24＋

A

1000－1492（2015）07－0991－05

2015－04－14接收

安徽省自然科學基金（編號：1208085QH172）

安徽醫科大學第一附屬醫院1腎臟內科、2檢驗科，合肥230022

張 培，女，碩士，副主任醫師；吳永貴，男，教授，主任醫師，博士生導師，責任作者，E-mail：wuyonggui＠medmail.com.cn