細(xì)胞DNA定量分析在鑒別良惡性胸腹水中的應(yīng)用價(jià)值

陶 偉，李俊

細(xì)胞DNA定量分析在鑒別良惡性胸腹水中的應(yīng)用價(jià)值

陶 偉，李俊

目的通過與液基細(xì)胞學(xué)（LBC）診斷比較，探討細(xì)胞DNA定量分析技術(shù)（DNA-ICM）在良惡性胸腹水診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法收集417例胸腹水標(biāo)本，分別采用LBC和DNA-ICM兩種方法判定其良惡性，并將兩種結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果417例胸腹水標(biāo)本均經(jīng)臨床或病理診斷證實(shí)，213例為惡性，204例為良性。DNA-ICM在胸腹水良惡性診斷中的敏感度、特異度、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值分別為89.7%、100%、94.7%、100%、90.3%；而LBC分別為63.4%、81.9%、72.4%、78.5%、68.2%；兩者之間敏感度、特異度、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論DNA-ICM在診斷胸腹水良惡性方面有較大應(yīng)用價(jià)值，與LBC聯(lián)合使用可提高胸腹水陽性檢出率，降低漏診率。

DNA定量分析技術(shù)；液基細(xì)胞學(xué)；腹水；胸水

胸腹水是常見的臨床體征，病因比較復(fù)雜，其良惡性的鑒別也是臨床上的難點(diǎn)。惡性胸腹水常見于原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤，惡性胸腹水的有無對(duì)臨床醫(yī)生在治療上有指導(dǎo)意義。目前細(xì)胞學(xué)是鑒別漿膜腔積液良惡性的主要手段，液基細(xì)胞學(xué)（liquid-based cytology，LBC）檢查簡(jiǎn)單易行，是臨床上鑒別胸腹水良惡性的一種常規(guī)診斷方法，但主要是形態(tài)學(xué)定性診斷，對(duì)于高度增生的間皮細(xì)胞、良惡性間皮瘤細(xì)胞以及轉(zhuǎn)移性腺癌細(xì)胞的鑒別診斷較為困難［1］。新興的細(xì)胞DNA定量分析技術(shù)（DNA image cytometry，DNA-ICM）通過分析細(xì)胞核內(nèi)DNA結(jié)構(gòu)和含量的變化，判斷細(xì)胞是否發(fā)生癌變。研究［2］顯示在大多數(shù)惡性胸腹水中均可發(fā)現(xiàn)DNA倍體異常細(xì)胞。異倍體細(xì)胞的出現(xiàn)反映染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目發(fā)生異常變化，也是細(xì)胞惡變的早期特征［3］。該研究通過與LBC診斷相比較，探討DNA-ICM在良惡性胸腹水診斷中的臨床價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集2014年5月～10月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院患者所送腫瘤內(nèi)科細(xì)胞室的胸腹水標(biāo)本417例，標(biāo)本均經(jīng)臨床或病理診斷證實(shí)。其中惡性胸腹水213例（肺癌56例、乳腺癌41例、宮頸癌4例、子宮內(nèi)膜癌14例、胃癌35例、十二指腸癌23例，結(jié)腸癌18例、直腸癌12例、肝癌9例、惡性間皮瘤1例），良性胸腹水204例（結(jié)核性胸膜炎27例、肺炎49例、支氣管擴(kuò)張5例、呼吸衰竭17例、冠心病26例、肝硬化55例、結(jié)核性腹膜炎8例、腸梗阻2例、盆腔結(jié)核15例）。男238例，女179例；年齡16～91歲，中位年齡57.9歲。對(duì)每例患者胸腹水標(biāo)本同時(shí)采用DNA-ICM和LBC檢查。

1.2 儀器與耗材液基沉降式染色機(jī)（廣州安必平醫(yī)療科技有限公司）；全自動(dòng)細(xì)胞DNA圖像定量分析系統(tǒng)（廈門麥克奧迪醫(yī)療診斷有限公司）；細(xì)胞保存液以及相關(guān)制片試劑（廈門麥克奧迪醫(yī)療診斷有限公司）。

1.3 方法每例100～150 ml新鮮胸腹水標(biāo)本采用沉降式LBC技術(shù)制成4張薄層細(xì)胞片，2張薄層細(xì)胞片行巴氏染色進(jìn)行LBC檢查。2張薄層細(xì)胞片行Feulgen染色行DNA-ICM。

1.3.1 LBC診斷 所有巴氏染色片由我科經(jīng)驗(yàn)豐富的腫瘤細(xì)胞學(xué)專家做出診斷。胸腹水LBC診斷結(jié)果分為4級(jí)，Ⅰ級(jí)：未見腫瘤細(xì)胞；Ⅱ級(jí)：查見少數(shù)異型細(xì)胞；Ⅲ級(jí)：查見可疑癌細(xì)胞；Ⅳ級(jí)：查見癌細(xì)胞。作統(tǒng)計(jì)分析時(shí)將Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)定為陰性，Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)定為陽性。

1.3.2 DNA-ICM診斷 所有Feulgen染色片用全自動(dòng)掃描圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描處理，該系統(tǒng)由全自動(dòng)數(shù)碼顯微鏡Motic BA600以及攝像頭205C對(duì)每張玻片8 000個(gè)以上的細(xì)胞核進(jìn)行掃描測(cè)定，以同張玻片上的正常細(xì)胞為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，并依據(jù)細(xì)胞核及核內(nèi)DNA的132個(gè)參數(shù)對(duì)被檢細(xì)胞進(jìn)行自動(dòng)分類和計(jì)數(shù)，其中DNA指數(shù)（DNA index，DI）為最關(guān)鍵的參數(shù)，可表示細(xì)胞中DNA含量。如為正常細(xì)胞，DI值多為1左右。如為正常增生或疑似病變細(xì)胞，則1＜DI＜2.5。如為病變細(xì)胞，則DI≥2.5。根據(jù)DNA-ICM所做的分析結(jié)果分為3級(jí)，Ⅰ級(jí)：以正常二倍體細(xì)胞為主，未見異倍體細(xì)胞以及異倍體細(xì)胞峰；Ⅱ級(jí)：可見少量DNA異倍體細(xì)胞（1～2個(gè)細(xì)胞，DI≥2.5）；Ⅲ級(jí)：可見大量DNA異倍體細(xì)胞（3個(gè)或3個(gè)以上細(xì)胞，DI≥2.5）以及異倍體細(xì)胞峰。只要出現(xiàn)DI≥2.5以上的細(xì)胞玻片，都要經(jīng)過腫瘤細(xì)胞學(xué)專家在顯微鏡下進(jìn)行核實(shí)，以排除系統(tǒng)將垃圾和重疊的細(xì)胞核誤認(rèn)為癌細(xì)胞或異常細(xì)胞。作統(tǒng)計(jì)分析時(shí)將Ⅰ級(jí)定為陰性，Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)定為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，率的比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 兩種檢查方法結(jié)果比較213例惡性胸腹水標(biāo)本中，LBC檢測(cè)135例陽性；DNA-ICM檢測(cè)191例陽性，其中162例出現(xiàn)3個(gè)或3個(gè)以上DI≥2.5的異倍體細(xì)胞或異倍體細(xì)胞峰，29例出現(xiàn)1～2個(gè)DI≥2.5的異倍體細(xì)胞。LBC查見癌或疑癌細(xì)胞的135例患者標(biāo)本中，DNA-ICM檢測(cè)有129例出現(xiàn)DI ≥2.5的異倍體細(xì)胞。LBC查見少數(shù)異型細(xì)胞的55例標(biāo)本中，DNA-ICM檢測(cè)有44例出現(xiàn)DNA指數(shù)（DI）≥2.5的異倍體細(xì)胞。6例LBC檢查為陽性而DNA-ICM檢測(cè)為陰性。204例良性胸腹水中，LBC檢測(cè)有37例出現(xiàn)假陽性，而DNA-ICM檢測(cè)全部陰性。見表1、圖1～3。

表1 417例良惡性胸腹水DNA-ICM與LBC診斷結(jié)果（n）

2.2 兩種檢查方法敏感度、特異度、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值比較417例良惡性胸腹水標(biāo)本中，DNA-ICM敏感度為89.7%（191／213）、特異度為100%（204／204）、準(zhǔn)確度為94.7%［（191＋204）／（213＋204）］、陽性預(yù)測(cè)值為100%（191／191）、陰性預(yù)測(cè)值為90.3%［204／（22＋204）］，高于LBC敏感度63.4%［（96＋39）／213］、特異度81.9%［（16＋151）／204］、準(zhǔn)確度72.4%［（96＋39 ＋16＋151）／（213＋204）］、陽性預(yù)測(cè)值78.5%［（96＋39）／（96＋39＋37）］、陰性預(yù)測(cè)值68.2%［（16＋151）／（16＋151＋55＋23）］，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3 兩種檢查方法與聯(lián)合檢查的比較DNA-ICM的敏感度為89.7%，LBC的敏感度為63.4%，聯(lián)合檢查的敏感度為92.5%［（191＋6）／213］。聯(lián)合檢查的敏感度高于LBC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示聯(lián)合檢查優(yōu)于LBC。聯(lián)合檢查的敏感度高于DNA-ICM，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

LBC檢查是臨床上鑒別胸腹水良惡性的一種常規(guī)檢查方法，其應(yīng)用于胸腹水的診斷雖然克服了傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)中細(xì)胞成分少、背景不清、涂片厚薄不一等缺點(diǎn)，但由于胸腹水中細(xì)胞數(shù)量比較少、細(xì)胞形態(tài)不典型，常常難以判斷其良惡性。隨著新的輔助診斷技術(shù)不斷出現(xiàn)，在診斷的過程中可以借助免疫細(xì)胞學(xué)和腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)方法，但由于其敏感度不高而易引起漏診［4－5］。DNA是細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和繁殖的基礎(chǔ)，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生癌變時(shí)，細(xì)胞內(nèi)DNA的含量和DNA在細(xì)胞核內(nèi)的分布以及排列方式均發(fā)生不同程度的改變，而這種改變是細(xì)胞癌變過程中最早期的變化［6］。正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞在生長(zhǎng)和增殖過程中，細(xì)胞內(nèi)的DNA含量均可發(fā)生變化，但腫瘤細(xì)胞的惡性本質(zhì)決定了其DNA含量變化的幅度和增殖的速度都與處于正常分裂周期的細(xì)胞有所區(qū)別，因此可以通過定量檢測(cè)細(xì)胞DNA含量變化來判定細(xì)胞是否發(fā)生癌變。

人體90%細(xì)胞都處于細(xì)胞周期中的靜止期，胸膜腔和腹膜腔表層的間皮細(xì)胞都屬于這一期，其DI 為1。當(dāng)間皮細(xì)胞處于分裂期時(shí)，其DI隨著細(xì)胞核內(nèi)DNA合成和染色體的分離發(fā)生變化，但應(yīng)該都在1～2之間，因此細(xì)胞DNA含量變化可以直接反映細(xì)胞增殖的能力。惡性胸腹水中的腫瘤細(xì)胞具有無限增殖能力，其細(xì)胞核DNA的含量明顯增加，測(cè)定細(xì)胞核DNA含量可以作為判斷惡性胸腹水的客觀依據(jù)［7］。

近年來應(yīng)用DNA-ICM鑒別細(xì)胞的良惡性已經(jīng)越來越受到臨床醫(yī)師的重視，并在宮頸癌、乳腺癌、食管癌、口腔腫瘤等多種腫瘤早期診斷中取得較高的診斷價(jià)值［8－11］，但在漿膜腔積液中的研究報(bào)道較少。本研究中DNA-ICM檢測(cè)胸腹水良惡性的敏感度、特異度分別為89.7%、100%，高于Kentrou et al［12］報(bào)道的85.1%、97.8%。同時(shí)研究顯示惡性胸腹水中，LBC檢測(cè)陽性的135例標(biāo)本中，DNA-ICM檢測(cè)129例為陽性，這是因?yàn)镈NA-ICM只能對(duì)DNA倍體已經(jīng)發(fā)生改變的腫瘤細(xì)胞做出診斷，對(duì)DNA倍體未發(fā)生改變的二倍體腫瘤檢測(cè)呈假陰性。另外，本研究顯示在惡性胸腹水中，LBC查見少數(shù)異型細(xì)胞的55例標(biāo)本中，DNA-ICM測(cè)定44例為陽性。這可能是由于細(xì)胞在發(fā)生癌變的過程中，細(xì)胞核DNA的含量和結(jié)構(gòu)的變化先于細(xì)胞形態(tài)的改變。

本研究中DNA-ICM檢測(cè)的敏感度、特異度高于LBC的敏感度、特異度，檢測(cè)效果優(yōu)于LBC。DNAICM通過全自動(dòng)數(shù)碼顯微鏡進(jìn)行閱片，仔細(xì)掃描每一個(gè)視野，降低了漏檢的可能，提高了檢測(cè)的敏感度［13］；通過圖像分析系統(tǒng)自主分析，測(cè)出每一個(gè)細(xì)胞DNA含量的具體數(shù)值，客觀準(zhǔn)確，提高了檢測(cè)的特異度和準(zhǔn)確度。

綜上所述，DNA-ICM的敏感度、特異度均較LBC檢查有優(yōu)勢(shì)，兩種檢查方法聯(lián)合有較大的診斷價(jià)值，可應(yīng)用于臨床，指導(dǎo)治療。

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Application of DNA image cytometry in distinguishing benign and malignant pleuroperitoneal fluids

Tao Wei，Li Jun
（Dept of Oncology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo investigate the value of DNA image cytometry in thediagnose of benign and malignant pleuroperitoneal fluids by comparing with the liquid-based cytological results.MethodsThere were 417 cases involved in this study.Pap stain for cytology analysis and feulgen stain for DNA image cytometry were used to identify benign and malignant pleuroperitoneal fluids respectively，then compared the results of the two methods.ResultsClinically or pathologically，213 were classified as malignant and the other 204 as benign.The sensitivity，specificity，accuracy，positive predictive value and negative predictivevalue of DNA image cytometry were 89.7%，100%，94.7%，100%，and 90.3%，respectively.However，the sensitivity，specificity，accuracy，positive predictive value and negative predictive value of liquid-based cytology were 63.4%，81.9%，72.4%，78.5%，and 68.2%，respectively.There were significant differences in thesensitivity，specificity，accuracy，positive predictive value and negative predictivevalue.ConclusionDNA image cytometry has great application value in the diagnosis of benign and malignant pleuroperitoneal fluids，and can increase the positive rate，reduce misdiagnosed rate with liquidbased cytology.

DNA image cytometry；liquid-based cytology；peritoneal effusion；pleural effusion

R 446.82

A

1000－1492（2015）07－1016－04

2015－03－27接收

衛(wèi)生部醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展研究項(xiàng)目（編號(hào)：W2013GJ42）

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，合肥 230022

陶 偉，男，碩士研究生；李 俊，女，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：93lijun＠163.com