16S rRNA序列分析技術對臨床標本中疑難細菌的鑒定

葉乃芳，凌華志，黃 穎，沈繼錄，徐元宏，王中新

16S rRNA序列分析技術對臨床標本中疑難細菌的鑒定

葉乃芳，凌華志，黃 穎，沈繼錄，徐元宏，王中新

目的應用16S rRNA序列分析技術鑒定臨床少見或疑難細菌，提高細菌鑒定的準確性。方法收集臨床少見或疑難細菌44株，提取DNA，采用通用引物進行PCR擴增及目的片段基因測序，并將測序結果在核酸數據庫中比對分析以確定菌種。結果44株臨床少見或疑難細菌均擴增到16S rRNA目的基因片段并成功測序，40株（90.9%）鑒定到“種”，4株（9.1%）鑒定到“屬”；其中常規方法與測序方法在“屬”水平一致的有34株（77.3%），不一致的有10株（22.7%）。結論16S rRNA序列分析技術可以準確、快速地鑒定臨床少見或疑難細菌，可以作為臨床細菌鑒定的重要方法之一。

16S rRNA基因；序列分析；細菌；鑒定

隨著人口老齡化、抗生素不恰當使用、免疫抑制劑應用及細菌培養條件的不斷改進，臨床標本培養出越來越多用常規方法難以鑒定的細菌。如何對這類細菌進行準確快速地鑒定，是臨床微生物室的一項重要任務。人類基因組計劃的完成以及后基因組計劃的實施，利用恒定區序列設計通用引物擴增16S rRNA基因片段的方法已經日趨成熟，并廣泛應用于生物學研究各個領域。目前，幾乎全部原核生物的16S rRNA基因序列已成功測序，并保存在公共的核酸序列數據庫中，可以迅速進行基因序列的同源性分析。該研究應用16S rRNA序列分析對44株臨床少見或疑難細菌進行鑒定，以評估該技術在細菌鑒定中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株選取2013年9月～2014年9月安徽醫科大學第一附屬醫院檢驗科分離的44株少見或疑難細菌。少見或疑難細菌入選標準：①臨床較少見或較難鑒定的細菌；②形態及生化反應不典型；③菌株分離部位特殊；④生長緩慢、全自動細菌鑒定系統鑒定耗時較長、可信度低或無鑒定結果的細菌。標準菌株ATCC 29213金黃色葡萄球菌、ATCC 25922大腸埃希菌、ATCC 27853銅綠假單胞菌、ATCC 17666嗜麥芽窄食單胞菌、ATCC 29212糞腸球菌來評價16S rRNA序列分析鑒定細菌的準確性。所有菌株保存于－80℃冰箱。

1.2 試劑與儀器Mueller-Hinton Broth肉湯（英國OXOID公司）；細菌DNA抽提試劑盒與PCR擴增試劑盒（上海生工生物公司）；DL 2 000 DNA Marker（日本TaKaRa公司）；PCR擴增儀（德國Biometra公司）；凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）；VITEK 2 COMPACT全自動細菌鑒定系統及配套GN、GP、NH、ANC鑒定卡片（法國生物梅里埃公司）；電泳儀（北京六一儀器廠）。

1.3 細菌總DNA提取將全自動細菌鑒定系統鑒定過的純菌落接種于配置好的Broth肉湯37℃搖菌過夜，取過夜菌液室溫8 000 r／min離心1 min，取沉淀按照細菌基因組DNA抽提試劑盒步驟提取細菌DNA。

1.4 16S rRNA基因擴增參照文獻［1］，選用16S rRNA基因細菌通用引物（27上游引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492下游引物：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′），引物由上海生工生物公司合成。PCR反應體系（50 μl）：上游引物（10 μmol／L）及下游引物（10 μmol／L）各2 μl、DNA模板1 μl、PCR Master 25 μl（含dNTPs、Taq DNA酶、Mg2＋）、加入滅菌去離子水22 μl。反應條件為94℃預變性3 min；94℃變性45 s，50℃退火45 s，72℃延伸90 s，35個循環，72℃延伸7 min。

1.5 PCR產物電泳取PCR產物5 μl于1%瓊脂糖電泳，使用5 μl DL 2 000分子量標準。溴乙錠染色后通過凝膠成像儀觀察，確認目標基因擴增成功后，PCR產物送上海生工生物公司，對PCR產物純化后測序，測序引物使用PCR擴增引物。

1.6 PCR產物測序分析將測得的序列用DNAMAN軟件進行序列校正，去除兩端圖譜不清的序列，并對雙向測通結果進行拼接。登陸GenBank和核糖體工程數據庫（RDP），在GenBank應用BLAST

對獲得的基因片段進行同源性檢索比對，初步得到細菌“屬”信息，以LPSN（http：／／www.bacterio.cict. fr）網頁中篩選模式菌株，參考CLSI MM18-A解釋標準［2］：①與模式菌株相似度≥99.0%且與其他種相似度之差＞0.8%，報告其種名；②與多個菌種的模式菌株相似度≥99.0%且相似度之差＜0.8%，則為“低鑒定度”的鑒定，應報告其屬名和所有相似度≥99.0%的種名；③與某屬細菌的相似度在97.0%～98.9%之間且能與其他菌屬相區分，報告其屬名并備注“親緣關系最近的菌種”；④與所有菌種的模式菌株相似度＜97%，則報告為可能的新屬新種。在RDP數據庫序列比對界面，Options中勾選上符合的Strain、Source、Size、Quality、Taxonomy，篩選excellent水平（高準確性）片段［3］。

1.7 兩種方法鑒定結果分析比較VITEK 2 COMPACT系統與16S rRNA序列分析結果同時對實驗菌株進一步復核生物學特點。

1.8 統計學處理應用SPSS 13.0軟件進行分析，兩方法鑒定水平差異（計數資料）用配對χ2檢驗。

2 結果

2.1 標準菌株16S rRNA基因鑒定5株標準菌株16S rRNA基因所測序列與核酸數據庫中的相應菌株作比對分析結果完全符合。

2.2 44株實驗菌株電泳結果經過16S rRNA基因PCR擴增，電泳凝膠系統成像，均在1 500 bp處獲得陽性產物，與預計片段大小吻合。見圖1。

2.3 VITEK 2 COMPACT系統與16S rRNA序列分析44株實驗菌株有34株（77.3%）常規方法與測序方法在屬水平一致，10株（22.7%）兩種方法在屬水平不一致。見表1。進一步復核生物學特點。見表2。

2.4 兩種方法鑒定水平比較VITEK 2 COMPACT 將31株（70.5%）鑒定到種水平，7株（15.9%）只鑒定到屬水平，6株（13.6%）未能鑒定。測序分析40株（90.9%）鑒定到種水平，4株（9.1%）鑒定到屬水平，兩種方法鑒定水平差異有統計學意義（P＝0.022）。16S rRNA序列分析鑒定到種水平成功率為90.9%，常規方法鑒定成功率為70.5%，提示16S rRNA序列分析的鑒別能力明顯高于常規方法。

3 討論

本研究運用16S rRNA序列分析技術，對臨床少見或疑難細菌進行鑒定，鑒定到種水平成功率為90.9%，而常規方法鑒定成功率為70.5%，與研究［4］一致，可見16S rRNA序列分析的鑒別能力明顯高于常規方法。

16S rRNA序列分析是臨床細菌鑒定的重要方法之一。首先，對常規方法只鑒定到屬的細菌鑒定至種，如本研究幾例不動桿菌屬的鑒定。不動桿菌屬生化反應相近，很難準確鑒定到種，統稱為乙酸鈣－鮑曼不動桿菌復合群，使用16S rRNA序列分析可以將部分不動桿菌鑒定至種［5］。不僅能提供正確結果，選擇合適的治療時機，還能進一步了解其流行病學及致病角色。其次，使用16S rRNA序列分析技術提高鑒定可信度［6］，本研究中將可信度低的洛菲不動桿菌準確鑒定為約翰遜不動桿菌，可能是洛菲不動桿菌、約翰遜不動桿菌枸櫞酸鹽利用試驗、丙二酸鹽利用實驗、精氨酸雙水解酶實驗不穩定引起；皮氏羅爾斯頓菌與臨床罕見的嗜銅菌屬表型非常相似，常規生化反應鑒定比較困難，用16S rRNA序列分析可以鑒定出來。另外，16S rRNA序列分析技術可以準確鑒定VITEK 2系統未能鑒定、生長緩慢的苛養菌、厭氧菌、少見菌等［7］。本研究中一株細菌在血平板呈粗糙針尖樣菌落，涂片革蘭陽性短桿狀，CAMP陰性，VITEK 2系統ANC卡未能鑒定，根據鏡檢形態、觸酶及改良抗酸染色陽性，初步判斷為馬紅球菌，進一步測序分析，鑒定是馬紅球菌。查閱VITEK 2儀器相關說明，不包括馬紅球菌鑒定信息，未能鑒定的深黃奈瑟球菌和氧化微桿菌也不在VITEK 2系統數據庫中，VITEK 2數據庫需要定期更新。本研究中一例壺腹部穿刺液，菌落細小，生長緩慢，VITEK 2系統GP卡未能鑒定，測序結果為副血鏈球菌，參考文獻［8］記載副血鏈球菌常分離自深部膿腫，尤其是肝、腦膿腫，精氨酸陽性，甘露醇、山梨醇、尿酸均陰性，其他生化反應不定；成功鑒定一株近十年內命名的具有明確臨床意義的新細菌Corynebacterium resistens［9］。該細菌來自一位食管惡性腫瘤患者血培養標本，為多重耐藥棒桿菌，與臨床醫師溝通認為是感染菌，中國鮮有報道。

表1 VITEK 2 COMPACT系統與16S rRNA序列分析鑒定

表2 鑒定結果不一致的菌株生化反應分析

序列比對分析使用GenBank及RDP數據庫，所含菌種目錄齊全，兩者比對結果基本吻合，但是比對伯克霍爾德菌屬分別歸屬吡咯伯克霍爾德菌及洋蔥伯克霍爾德菌，據Gee et al［10］報道，伯克霍爾德菌幾個種的堿基位點只有微小差異，相似率可達99%以上。另一方面不同數據庫搜集16S rRNA序列數據質量和一致性均存在差異，Cloud et al［4］認為任何方法的準確性都依賴于數據庫的及時更新。16S rRNA序列分析由于選擇的引物序列保守，對部分近緣菌的分辨率低，且基因水平轉移、基因突變等均可能影響16S rRNA序列分析的準確性［11］。常規法從標本送檢到得出鑒定結果需要3～5 d，如果遇到難以鑒定的細菌可能需要更長時間，16S rRNA序列分析整個過程只需2～3 d。后續實驗將在傳統生化反應鑒定的基礎上，恰當應用16S rRNA及其他管家基因的序列分析技術進一步提高對細菌的鑒定能力。

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Application of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of clinical unidentifiable bacteria

Ye Naifang，Ling Huazhi，Huang Ying，et al
（Dept of Clinical Laboratory，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo apply an approach based on 16S rRNA gene sequences analysis for identification of clinical rare and unidentifiable bacteria in order to improve the accuracy of clinical diagnosis.MethodsA total of 44 clinical isolates were collected，the bacteria DNA was extracted followed by PCR amplification for 16S rRNA gene with a universal primer.The PCR products were sequenced.The confirmed sequences were compared to the reference sequences obtained from GenBank and RDP databases.ResultsAll of the 44 clinical isolates obtained the target genes successfully.40 strains（90.9%）were specified to the species level and 4 strains（9.1%）were specified to the genus level.77.3%（34／44）of sequencing results were concordant with phenotypic results，22.7%（10／44）of sequencing results were not concordant with phenotypic results.Conclusion16S rRNA gene sequence analysis can be accurate，rapid identification of clinical rare bacteria and bacteria with unusual phenotypic profiles.

16S rRNA gene；sequence analysis；bacteria；identification

R 446.5

A

1000－1492（2015）07－1000－04

2015－03－17接收

安徽省高校省級自然科學研究項目（編號：KJ2010A174）

安徽醫科大學第一附屬醫院檢驗科，合肥 230022

葉乃芳，女，碩士研究生；王中新，男，主任技師，碩士生導師，責任作者，E-mail：aywzhx87＠163.com