大麻素受體-2對小鼠結腸炎作用機制研究

李 凱，吳正祥，楊 楓

大麻素受體-2對小鼠結腸炎作用機制研究

李 凱1，吳正祥1，楊 楓2

目的觀察大麻素受體-2（CB2）對急性實驗性小鼠結腸炎的作用，探討CB2對腸黏膜內質網應激（ERS）影響。方法32只SPF小鼠隨機分為正常組、模型組、CB2激動劑組、CB2拮抗劑組，每組8只。記錄小鼠疾病活動度及結腸組織病理學評分，ELISA法檢測結腸組織中炎癥因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-10（IL-10）水平，免疫組化法檢測結腸組織CB2及ERS相關蛋白GRP78、CHOP表達，RT-PCR法檢測結腸組織中GRP78、CHOP mRNA水平。結果與正常組比較，模型組TNF-α水平顯著上調、IL-10水平下降（P ＜0.05），GRP78、CHOP蛋白及mRNA顯著增高（P＜0.05）。與模型組比較，CB2激動劑組CB2表達明顯增多（P＜0.05），TNF-α水平下降（P＜0.05），IL-10水平增多（P＜0.05），GRP78、CHOP蛋白及mRNA顯著下降（P＜0.05）。CB2拮抗劑組TNF-α、IL-10、ERS標記物水平與模型組差異無統計學意義。結論實驗性結腸炎小鼠腸黏膜存在劇烈的ERS，CB2激動劑激活CB2表達后緩解結腸炎小鼠腸道炎癥，可能與CB2抑制腸黏膜ERS有關。

結腸炎；大麻素受體-2；內質網應激；GRP78

炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）是一類胃腸道慢性免疫異常疾病，包括克羅恩病和潰瘍性結腸炎。內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是IBD發生的重要機制之一，抑制ERS對緩解腸內炎癥有重要作用。大麻素受體－2（cannabinoid receptor－2，CB2）是體內新近發現的新型物質，研究［1］顯示CB2能夠改善腸內炎癥，但其具體機制不明。該實驗通過建立急性實驗性結腸炎小鼠模型，觀察CB2對小鼠結腸炎的作用，并從ERS方面探討CB2改善結腸炎的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 50只SPF級雄性C57BL／6小鼠，6周齡，體重18～22 g，購自安徽醫科大學動物實驗中心。

1.1.2 主要試劑 葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS，相對分子質量5 000）、CB2激動劑JWH-133（美國Sigma公司）；CB2拮抗劑AM630（英國Tocris公司）；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）、白介素-10（interleukin-10，IL-10）ELISA試劑盒（北京四正柏生物科技有限公司）；CB2單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；GRP78、CHOP多克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；過氧化物酶標記的鏈酶卵白素SP染色試劑盒及DAB顯色劑（北京中杉金橋生物技術有限公司）；TRIzol試劑（上海Roche公司）；RT試劑盒、DNA Marker （DL1000，大連TaKaRa公司）；RT-PCR引物（上海生工生物工程技術服務有限公司）；大便隱血檢測試劑盒（杭州艾康生物技術有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及急性結腸炎模型建立 將50只C57BL／6小鼠適應性飼養1周后，挑選體重、健康程度接近的小鼠32只，編號后隨機分為正常組、模型組、干預組（CB2激動劑組和CB2拮抗劑組），每組8只。模型組和干預組小鼠連續飲用5%DSS蒸餾水7 d，正常組飲用普通蒸餾水，以大便帶血（大便隱血試劑盒檢測）、稀便、體重減輕作為急性結腸炎造模成功標志［2］。造模結束后，將CB2激動劑JWH-133、CB2拮抗劑AM630溶于3%DMSO，按10 mg／（kg·d）劑量分別給予對應干預組小鼠腹腔注射，每天1次，連續干預7 d［3］，正常組、模型組腹腔注射等體積3%DMSO＋0.9%NaCl溶媒作為對照。

1.2.2 觀察指標及檢測方法 ①疾病活動度（disease activity index，DAI）評分，DAI＝（體重指數＋大便形狀＋出血情況）／3［4］；②病理學評分：給藥結束后，禁食1 d，取出結腸組織，PBS沖洗后縱切，在結腸末端（距肛門1 cm處）剪取0.5 cm結腸，經中性福爾馬林固定、石蠟包埋后切片，行HE染色，根據Cooper et al［5］組織學評分標準進行病理學評分（histopathological score，HS）；③ELISA法檢測結腸組織TNF-α、IL-10表達：嚴格按照試劑盒說明書步驟；④免疫組化法檢測結腸組織CB2、GRP78、CHOP表達：組織包埋、切片、抗原修復，滴加抗體，DAB顯色，蘇木精復染，封片；CB2一抗濃度1∶500，GRP78一抗濃度1∶300，CHOP一抗濃度1∶300，陰性對照采用PBS代替，光鏡下隨機觀察5個不同高倍視野（×400），采用Imagepro plus 6.0軟件進行圖像分析，以平均光密度（optical denesity，OD）值代表表達強度；⑤RT-PCR法檢測GRP78、CHOP mRNA表達：TRIzol法提取結腸組織RNA，逆轉錄合成cDNA用于PCR擴增，95℃預變性5 min，95℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸1 min，GRP78、CHOP、β-actin退火溫度分別為58、59、57℃，循環數分別為34、34、32個，擴增結束后行凝膠電泳，電壓100 V，電泳時間40 min，采用凝膠成像分析系統觀察結果，分析GRP78、CHOP mRNA相對表達量，結果以GRP78、CHOP mRNA與β-actin的比值表示。各基因引物序列及擴增片段見表1。

表1 目的基因引物序列、擴增片段

1.3 統計學處理采用SPSS 16.0軟件進行分析，數據以±s表示。多組間數據比較采用單因素方差分析，方差不齊采用秩和檢驗，相關性分析采用雙變量Bivariate相關分析法。

2 結果

2.1 DAI、HS評分及TNF-α、IL-10表達與正常組比較，模型組DAI、HS、TNF-α水平明顯升高（P＜0.05），IL-10水平下降（P＜0.05）；與模型組比較，CB2激動劑組DAI、HS、TNF-α水平明顯下降（P＜0.05），IL-10水平升高（P＜0.05）；CB2拮抗劑組與模型組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

2.2 免疫組化法檢測CB2、GRP78、CHOP表達CB2激動劑組CB2表達明顯高于正常組、模型組、CB2拮抗劑組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。4組小鼠間結腸組織GRP78、CHOP表達差異有統計學意義（F＝197.20、98.121，P＜0.05）。正常組結腸組織上皮細胞中可見少量GRP78、CHOP表達，以細胞質表達為主；與正常組比較，模型組結腸組織中GRP78、CHOP表達顯著增多（P＜0.05）；與模型組比較，CB2激動劑組GRP78、CHOP表達減少（P＜0.05）；CB2拮抗劑組與模型組差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1、表3。

表2 各組小鼠DAI、HS評分及TNF-α、IL-10表達（n＝8，±s）

表2 各組小鼠DAI、HS評分及TNF-α、IL-10表達（n＝8，±s）

與正常組比較：*P＜0.05；與模型組比較：＃P＜0.05

項目正常組模型組CB2激動劑組CB2拮抗劑組DAI（分）0.00±0.003.21±0.35*1.21±0.31＃3.33±0.44 HS（分）0.00±0.007.38±3.42*4.50±1.41＃7.63±3.02 TNF-α（μg／L）57.67±6.78123.49±10.46*92.67±10.62＃125.68±8.76 IL-10（μg／L）375.22±16.91 122.46±9.79*235.39±21.05＃121.74±13.92

表3 各組小鼠結腸組織CB2、GRP78、CHOP 及mRNA表達（n＝8，±s）

表3 各組小鼠結腸組織CB2、GRP78、CHOP 及mRNA表達（n＝8，±s）

與正常組比較：*P＜0.05；與模型組比較：＃P＜0.05；與CB2拮抗劑組比較：△P＜0.05

項目正常組模型組CB2激動劑組CB2拮抗劑組CB20.21±0.080.23±0.050.76±0.09*＃△0.15±0.05 GRP780.42±0.061.48±0.10*0.71±0.09＃1.39±0.15 CHOP0.45±0.070.90±0.05*0.66±0.07＃0.92±0.06 GRP78 mRNA 0.13±0.040.72±0.08*0.46±0.07＃0.74±0.11 CHOP mRNA0.16±0.050.84±0.14*0.50±0.08＃0.86±0.12

2.3 GRP78、CHOP mRNA表達各組小鼠結腸組織GRP78、CHOP mRNA表達總體差異有統計學意義（F＝104.610、85.269，P＜0.05）。正常組GRP78、CHOP mRNA表達較少，條帶微弱，模型組條帶明亮，mRNA表達顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，CB2激動劑組條帶稍暗，mRNA表達減少，差異有統計學意義（P＜0.05）；CB2拮抗劑組與模型組差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2、表3。

2.4 相關性分析CB2激動劑組中CB2表達與IL-10呈正相關性（r＝0.916，P＜0.05），與DAI、HS、TNF-α表達呈負相關性（r＝－0.778、－0.749、－0.926，P＜0.05），與GRP78及其mRNA表達呈負相關性（r＝－0.865、－0.932，P＜0.05），與CHOP及其mRNA呈負相關性（r＝－0.744、－0.803，P＜0.05）。

3 討論

CB2在體內主要表達于外周免疫細胞，參與免疫調節，具有抗炎、抗氧化、抗增殖作用。眾多研究［3，6］證實，CB2減少腸上皮炎癥細胞浸潤及黏膜炎癥損害，對腸內炎癥具有抑制作用。本實驗誘導小鼠發生結腸炎后，小鼠DAI、HS評分增加，CB2激動劑組DAI、HS評分較模型組明顯減輕，證實CB2能夠改善小鼠結腸炎癥狀。腸道炎癥是IBD發展過程中的重要環節，大量促炎癥因子分泌，抗炎因子減少。本實驗顯示，模型組小鼠腸黏膜中促炎因子TNF-α表達顯著增加，抗炎因子IL-10表達減少，表明有腸道炎癥發生。CB2激動劑組給予JWH-133激活CB2表達后，CB2表達增加，小鼠DAI、HS評分均減少，抗炎因子IL-10水平上調，促炎因子TNF-α水平下調；CB2拮抗劑組使用AM630抑制CB2表達后，炎癥因子變化不明顯，推測CB2緩解實驗性小鼠結腸炎與其抑制炎癥免疫反應有關。

初期的ERS是一種適應性代償過程，ERS持續發生時，將啟動CHOP途徑等多種細胞凋亡通路，通過程序性死亡，清除過多的受損細胞［7］。GRP78、CHOP作為經典標記物反映ERS水平。研究［8－9］顯示ERS與IBD聯系緊密。實驗［8］證明活動期克羅恩病患者腸上皮中GRP78表達高于正常人群，提示發生ERS。研究［9］顯示，潰瘍性結腸炎患者結腸黏膜組織存在大量ERS，甚至可以發生于非炎癥組織，而對照組中卻未發現，認為可以把ERS作為潰瘍性結腸炎的一般特征。本實驗模型組小鼠腸黏膜中ERS標記蛋白GRP78及其mRNA表達顯著增多，提示小鼠腸內已經存在劇烈的ERS，與上述研究結果一致。CHOP蛋白表達增加，提示腸上皮細胞中發生大量ERS相關凋亡反應，過多的細胞凋亡使腸上皮細胞數量急劇減少，促進腸內炎癥進展。

研究［10］顯示，與野生型小鼠比較，IL-10－／－小鼠發生慢性腸道炎癥后，腸上皮細胞中GRP78蛋白表達增多，增加IL-10表達后，GRP78表達減少，這可能與IL-10調節p38信號通路抑制ATF6轉錄，以此減輕ERS有關。推測腸道炎癥反應與ERS存在一定關系。本實驗顯示，模型組小鼠ERS標記物GRP78表達上調與炎癥水平相一致，激活CB2表達改善腸內炎癥后，GRP78表達下降，CB2抑制ERS可能是緩解結腸炎癥的機制之一。CB2激動劑組CHOP表達減少，提示CB2抑制腸上皮細胞ERS相關凋亡通路，避免腸上皮細胞過度減少，有利于腸上皮組織恢復、愈合。本實驗中，CB2激動劑組GRP78、CHOP蛋白與基因下調水平同步，說明CB2主要通過抑制應激蛋白mRNA轉錄緩解ERS。

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Research the mechanism of cannabinoid receptor-2 on colitis in mice

Li Kai1，Wu Zhengxiang1，Yang Feng2
（1Dept of Gastroenterology，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001；2Dept of Clinical Laboratory，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical Uniersity，Hefei 230022）

ObjectiveTo observe the role of cannabinoid receptor-2（CB2）in acute experimental colitis in mice，and to explore its effect on the endoplasmic reticulum stress（ERS）in the intestinal mucosa.Methods32 SPF mice were randomly divided into normal group，model group，CB2 agonist group and CB2 antagonist group.Disease activity index（DAI）and colon histopathological score（HS）were evaluatd.The levels of TNF-α and IL-10 in colon tissue were detected by ELISA.The expression of CB2 and ERS markers GRP78，CHOP in colon tissues were detected by immunohistochemical.The mRNA levels of GRP78 and CHOP were detected by RT-PCR.ResultsCompared with the normal group，the level of TNF-α was significantly higher and the level of IL-10 was significantly lower（P＜0.05）in the model group，the expressions of GRP78，CHOP and its mRNA were significantly higher（P＜0.05）.Compared with the model group，the expression of CB2 in the CB2 agonist group was significantly higher（P ＜0.05），the level of TNF-α dropped and the level of IL-10 increased（P＜0.05），and the expressions of GRP78，CHOP and its mRNA were significantly reduced（P＜0.05）.The level of IL-10，TNF-α and ERS markers had no significant difference bewteen CB2 antagonist group and the model group（P＞0.05）.ConclusionSevere endoplasmic reticulum stress exists in intestinal mucosa of experimental colitis mice.The CB2 agonist activates CB2 expression，reducing colitis in mice.Its mechanism may be related to inhibiting ERS in intestinal mucosa.

colitis；cannabinoid receptor-2；endoplasmic reticulum stress；GRP78

R 574.62

A

1000－1492（2015）07－0954－04

2015－03－02接收

安徽省衛生廳醫學科研項目（編號：13zc041）

1安徽省立醫院消化內科，合肥 230001

2安徽醫科大學第一附屬醫院病理學教研室，合肥230022

李 凱，男，碩士研究生；吳正祥，男，教授，主任醫師，碩士生導師，通訊作者，E-mail：zxiangwu＠126.com