C57BL／6小鼠放射性心臟損傷動物模型的建立及血清標志物的探討

符天曉，周菊英，焦 旸

C57BL／6小鼠放射性心臟損傷
動物模型的建立及血清標志物的探討

符天曉1，周菊英1，焦 旸2

目的探討放射性心臟損傷動物模型建立方法和相關血清標志物。方法雌性C57BL／6小鼠28只，隨機分為3組：對照組（4只），18 Gy放療組（12只），25 Gy放療組（12只）。每周測小鼠體重，分別于照射后第0、8、16周，取心肌組織行HE染色，觀察心臟病理組織改變并進行評分；采集下腔靜脈血檢測心肌肌鈣蛋白I（cTnI）。結果與對照組比較，放療組小鼠的體重開始呈下降趨勢后緩慢上升。放療組小鼠的心肌組織存在明顯的組織病理學改變，早期以急性炎癥為主，后期以進行性纖維化為特征；隨著受照劑量的增加，炎性反應和纖維化程度加重，病變時間提前。cTnI隨時間變化呈升高趨勢，和劑量大小、病理學表現均呈相關性。結論成功建立放射性心臟損傷動物模型。cTnI可作為評價心臟損傷動物模型的無創性指標。

放射性心臟損傷；動物模型；評價方法；肌鈣蛋白

1970年，Fajardo et al［1］首次證實射線能引起心臟損傷，自此放射性心臟疾病（radiation-induced heart disease，RIHD）這一名詞得以確定，該疾病越來越引起相關研究者的重視。胸部放射治療過程中不可避免地使一定體積的心臟組織受到照射，從而發生RIHD，多見的是遲發性心臟損傷［2－3］。臨床資料顯示，輕度RIHD表現為血清酶升高、心功能降低、心率失常及心電圖異常，重度為急慢性心包炎、心肌炎，最終導致心肌硬化和冠心病［4－5］。心臟已被公認為是胸部放療的劑量限制器官之一［6］。該研究旨在建立C57BL／6小鼠放射性心臟損傷模型，并初步探索可靠的評價標準，為RIHD的臨床研究提供可靠的基礎研究依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雌性C57BL／6小鼠，SPF級，6 ～8周齡，體重18～22 g，購自蘇州大學實驗動物中心。在恒溫（22±2）℃、濕度（50±10）%、正常光照中適應性飼養1周后實驗。

1.1.2 儀器及試劑 模擬定位機（荷蘭核通公司）；自制C57固定木板；1%戊巴比妥鈉（美國Sigma）；PRIMUS M型直線加速器（德國西門子公司）；強生vitros5600型全自動生化分析儀（美國強生公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組［7－8］將實驗動物隨即分為3組：對照組4只（不做任何處理），18 Gy放療組12只，25 Gy放療組12只。

1.2.2 建立動物模型 首先用1%戊巴比妥鈉1 ml進行腹腔麻醉，待動物麻醉成功后，利用自制木板固定小鼠，在模擬定位機下確定小鼠心臟輪廓。照射方法：機架角＝0°，6 MV能量的X射線采用源皮距（source skin distance，SSD）＝100 cm方法垂直照射。照射劑量：根據小鼠心臟大小及深度分別計算各劑量組所需出束劑量，具體公式為：Mu＝Dd× 100／PDD（r，d，SSD）×Sc（rc）×Sp（r）×Kc。其中腫瘤量（Dd）分別為18、25 Gy；查表可得百分深度量（PDD）、準直器散射因子（Sc）、體模散射因子（Sp）；托架因子（Kc＝0.946）。照射結束待動物麻醉清醒后送回動物房，試驗過程中無動物死亡。

1.2.3 動物模型的評價 觀察小鼠活動、飲食、體重變化。小鼠于放療后每周稱重1次；分別于第8周、第16周處死小鼠，收集下腔靜脈抗凝全血測定心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）。開胸取心臟（注意保留心房），用10%福爾馬林固定心臟，常規石蠟包埋切片后HE染色，光鏡下觀察心肌組織結構，予病理評分。具體評分標準，0級：正常心肌結構，心肌細胞無萎縮與肥大，無空泡，橫紋清晰，心肌排列整齊，心內、外膜均無異常，血管和間質無變化；1級：散在的單個心肌細胞表現為局部肌漿溶解和空泡，而鄰近的心肌細胞仍正常；2級：小至中等范圍的成簇心肌細胞表現有萎縮、肌漿溶解和空泡，可見小灶性心肌細胞壞死；3級：大范圍彌漫性心肌細胞萎縮、肌漿溶解或空泡，有較明顯的壞死。根據情況，可在1～2級，2～3級之間評分，如1.5、2.5等［9］。

1.3 統計學處理采用SPSS 11.5軟件進行分析，數據以±s表示。多組間差異的比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）。

2 結果

2.1 體重及生長情況觀察與對照組比較，18 Gy放療組和25 Gy放療組小鼠的體重開始呈下降趨勢，1周后緩慢上升（圖1），小鼠在后期出現厭食、形體消瘦、心臟體表投影區域脫毛、活動緩慢等現象；而對照組小鼠體重呈增長趨勢，飲食、活動一切正常，皮毛柔順亮澤，小鼠未見死亡。

2.2 組織病理變化HE染色可見對照組小鼠心肌組織無滲出和充血水腫，肌纖維排列正常，結構清晰（圖2A）。而18 Gy放療組的心肌組織病變初期（照射后8周）以炎性滲出為主，主要表現為心肌間充血水腫（圖2B）；25 Gy組伴有炎性細胞的浸潤，切片中尚見到一些無核的細胞，似脂肪細胞（圖2C）；照射16周后，18 Gy放療組小鼠的心肌組織以進行性纖維化為特征，表現為心肌間隙增寬，肌纖維排列紊亂，橫紋不清晰，纖維蛋白滲出（圖2D）；25 Gy組出現局灶性心肌變性以及肌漿凝聚（圖2E）。

對照組心肌病理評分為0分，第8周18 Gy與25放療Gy組病理評分均上升。18 Gy放療組與對照組比較差異無統計學意義，而25 Gy放療組與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。第16周，18 Gy、25 Gy放療組與對照組比較差異均有統計學意義（P＜0.01）。見表1。

表1 放射性心臟損傷小鼠病理評分表（±s）

表1 放射性心臟損傷小鼠病理評分表（±s）

與對照組比較：**P＜0.01

時間對照組（n＝4）18 Gy放療組（n＝12）25 Gy放療組（n＝12）第8周0.00±0.000.42±0.661.00±0.55**第16周0.00±0.001.33±0.41**2.08±0.38**

表2 放射性心臟損傷小鼠血清中cTnI含量（±s）

表2 放射性心臟損傷小鼠血清中cTnI含量（±s）

與對照組比較：*P＜0.05；與18 Gy放療組比較：＃P＜0.05

時間對照組（n＝4）18 Gy放療組（n＝12）25 Gy放療組（n＝12）第8周0.10±0.030.15±0.05*0.19±0.03*第16周0.11±0.030.25±0.04*0.32±0.03*＃

2.3 cTnI檢測結果在第8周和第16周，與對照組比較，放療組小鼠血清中cTnI含量升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；在第8周，與18 Gy放療組比較，25 Gy放療組小鼠血清中cTnI含量升高，差異無統計學意義（表2）。在第16周，25 Gy放療組小鼠血清中cTnI含量最高，與18 Gy放療組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。研究顯示，小鼠血清中cTnI含量與放射劑量、時間均呈明顯的相關性，提示cTnI作為血清標志物可用于評價放射性心臟損傷模型的程度。

3 討論

近年來，動物模型的建立和應用在研究RIHD的發病機制、病理生理學改變中起到重要的作用。目前，動物模型建立的方法有很多，但是放射靶區確定、劑量選擇以及評判標準尚不明確。本試驗在模擬定位機下觀察每只小鼠的心影、運動范圍，嚴格控制放療靶區為2.0 cm×1.5 cm，并根據射野定位片設計不規則擋鉛區域，物理師嚴格校準加速器，精確計算劑量，使心臟得到精確照射。本研究中除心臟損傷外，周圍組織均正常，未發生炎癥和纖維化等病理改變，符合放射性心臟損傷動物模型建立標準。

射線對心臟損傷的主要靶細胞是心肌間豐富的毛細血管內皮細胞，導致炎癥、凝血與血栓、冠狀動脈粥樣硬化。這些反應影響了冠狀動脈的血流以及微循環對心肌的供血，從而引起放射性心臟損傷。白蘊紅等［10］人以鈷60伽瑪射線30 Gy照射SD大鼠心臟，發現大鼠心臟呈三型改變：①變性滲出型：心肌充血、出血，心肌間有纖維蛋白滲出及炎性細胞浸潤，部分心肌細胞變性，局灶性肌漿凝聚，此型病變多見于照射后0.5和1個月，之后呈減輕、發生減少趨勢；②壞死型：多位于心內膜下，心肌有點片狀壞死病灶，另外，尚見一些心肌細胞呈空泡狀，似脂肪細胞，此型變化最早見于單次照射30 Gy后2個月；③纖維化型：最早見于單次照射30 Gy后3個月，始見小的成纖維細胞團，于照射后6個月，見心肌間局部纖維細胞增多和膠原纖維增生。本實驗中病理學變化和以上研究結果相似。

心臟屬于晚反應器官，傳統的心電圖改變往往出現較晚，發生時間為3～5年［11］。心肌細胞內有大量的心肌酶，由于心肌細胞的缺血、壞死會導致細胞膜通透性增加，使得各種酶釋放入血液，血清心肌酶升高。RIHD單次破壞心肌細胞數量較少，傳統心肌酶如肌酸激酶（creatine kinase，CK）、CK同工酶（CK-MB）敏感度不高；CK及CK-MB存在于心肌細胞胞質外，還存在于骨骼肌細胞胞質中，特異性不高。肌鈣蛋白僅存在于心肌細胞，是心肌損傷的特異性血清標志物。當心肌細胞受到損傷，肌鈣蛋白的血清濃度（3～6 h）可升高10～100倍，而CK、CKMB（3～8 h）僅升高2～20倍，肌鈣蛋白對診斷心肌損傷敏感性高。同時，肌鈣蛋白升高持續時間長達2～3周，而CK、CK-MB僅持續幾天，肌鈣蛋白診斷時間窗寬［12］。本實驗選擇cTnI作為血清標志物用于評價模型心臟損傷，具有特異性敏感性高、診斷時間窗寬等特點。實驗中取下腔靜脈血cTnI檢測，不同實驗組cTnI檢測結果和放療劑量大小呈相關性；隨時間變化，檢驗結果和心臟的晚反應病理變化特點相吻合。

綜上所述，以C57BL／6小鼠心臟作為靶區精確放療，單次劑量25 Gy，放療后16周可成功建立放射性心臟損傷小鼠模型，可用于放射性心臟損傷疾病研究。病理切片及評分可作為評價建模成功與否的標準，cTnI可作為無創性方法用來評價動物模型。

［1］ Fajardo L F，Stewart J R.Experimental radiation-induced heart disease.1.Light microscopic studies［J］.Am J Pathol，1970，59（2）：229－316.

［2］ Gustavsson A，Osterman B，Cavallin-St?hl E.A systematic over view of radiation therapy effects in Hodgkin’s lymphoma［J］.Acta Oncol，2003，42（5－6）：605－19.

［3］ Giraud P，Cosset J M.Radiation toxicity to the heart：physiopathology and clinical data［J］.Bull Cancer，2004，91 Suppl 3：147－53.

［4］ 李興鳳.放射性心臟損傷10例臨床分析［J］.山東醫藥，2007，47（26）：108－10.

［5］ 郭兆嬌，楊 林.放射治療導致心臟損害及其檢測與防護［J］.安徽醫科大學學報，2014，49（9）：1353－4.

［6］ Stewart J R，Fajardo L F.Radiation-induced heart disease：an update［J］.Prog Cardiovase Dis，1984，27（3）：173－94.

［7］ 徐久宏，高耀明，張軍寧，等.大鼠心臟放射損傷對內皮素-1和心肌肌鈣蛋白I表達水平的影響［J］.蘇州大學學報，2011，31 （3）：354－6.

［8］ 呂 鵬，臧愛民.血清肌鈣蛋白I在放射性心臟損傷中的變化及右丙亞胺對其影響［J］.長治醫學院學報，2013，27（2）：94－6.

［9］ 周明東.神經調節蛋白用于心血管疾病治療的方法和組合物［P］.中國專利CN 101007027 A：2007－08－01.

［10］白蘊紅，王德文.大鼠放射性心臟的病理學觀察［J］.中華放射醫學與防護雜志，1994，14（5）：329－30.

［11］Allavena C，Conroy T，Aletti P.Late cardiopulmonary toxicity after treatment for Hodgkin’s disease［J］.Br J Cancer，1992，65（6）：908－12.

［12］郭 瑋，潘柏申.心肌肌鈣蛋白－心肌損傷的確定生化標志物［J］.上海醫學檢驗雜志，2000，15（1）：81－3.

Establishment of irradiation induced heart injury in C57 mice model and identification of serum marker

Fu Tianxiao1，Zhou Juying1，Jiao Yang2
（1Dept of Oncological Radiotherapy，The First Affiliated Hospital of Soochow University，2School of Radiation Medicine and Public Health of Soochow University，Suzhou 215006）

ObjectiveTo establish and investigate C57BL／6 mice model of radiation induced heart injury and serum marker.MethodsTwenty eight female C57BL／6 mice were randomly divided into 3 groups：normal group（n ＝4），18 Gy radiation therapy group（n＝12），25 Gy radiation therapy group（n＝12）.The mice were weighed every week.Respectively，0，8 and 16 weeks after irradiation，the pathological changes of myocardial tissue were observed by hemetoxylin-eosin（HE）staining and made pathological score.Inferior vena cava blood was collected to take cardiac troponin I（cTnI）test.ResultsCompared with the normal group，the weight of radiation group went down first then went up slowly.The myocardial tissue from mice had obvious histopathological changes.Acute inflammation was the main change in the early days.At the late stage，progressive fibrosis was the main characteristic.With the increase of the dose，the inflammatory reaction and fibrosis degree had aggravated，pathological changes had occurred earlier.cTnI showed a trend of higher performance over time，and had a correlation with pathology.ConclusionWe successfully established radiation induced myocaridal injury model.As a noninvasive serum marker，cTnI can be used as the evaluation standard of radiation induced myocardial injury animal model.

radiation induced heart injury；animal model；evaluation method；cardiac troponin I

Q 95-3；R 818.74

A

1000－1492（2015）07－0922－04

2015－03－20接收

國家青年自然基金項目（編號：81302382）

蘇州大學1附屬第一醫院腫瘤放療科、2放射醫學與公共衛生學院，蘇州 215006

符天曉，男，主管技師；焦 旸，女，副教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：jiaoyang＠suda.edu.cn