microRNA-1271靶向調控白血病細胞CYLD蛋白的表達

張 茜，王媛媛，劉麗萍，倪 芳

microRNA-1271靶向調控白血病細胞CYLD蛋白的表達

張 茜1，王媛媛1，劉麗萍1，倪 芳2

目的探討人白血病細胞中微小RNA（microRNA）-1271對CYLD蛋白表達的調控作用。方法qRT-PCR檢測microRNA-1271在不同的人白血病細胞系、臨床初診未治的幾種類型原代白血病細胞、正常人外周血單個核細胞中的表達差異，利用Targetscan信息學預測軟件預測microRNA-1271靶向CYLD基因，構建攜帶靶基因野生型及突變型3’非翻譯區（3’UTR）（缺失了整段預測的microRNA-1271結合序列）的雙熒光素酶報告基因質粒，采用脂質體Lipofectamine 3000包裹雙熒光素酶重組質粒及microRNA-1271模擬物（mimic）或陰性對照，共轉染HEK293A細胞，應用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定熒光素酶活性。FAM標記的microRNA-1271抑制物和陰性對照分別核轉染至人白血病細胞系K562細胞，Western blot法檢測CYLD蛋白水平的表達變化。結果microRNA-1271在不同人白血病細胞系以及臨床初診未治的原代白血病細胞中的表達均明顯高于正常人外周血單個核細胞，雙熒光素酶報告基因實驗驗證CYLD是microRNA-1271的潛在靶基因；K562細胞中轉染microRNA-1271抑制物下調microRNA-1271后，Western blot法檢測結果顯示CYLD蛋白水平明顯上調。結論人白血病細胞中microRNA-1271的表達上調，下調microRNA-1271后可以促進靶基因CYLD蛋白的表達，microRNA-1271有可能成為白血病治療的新靶點。

白血病；microRNA；microRNA-1271；CYLD

微小RNA（microRNA）是存在于真核細胞內的大小為18～25個核苷酸的單鏈非編碼RNA，microRNA作為調控基因表達的重要分子，可以通過與靶mRNA的3’非翻譯區（3’UTR）特異性結合，從而導致靶mRNA的降解或抑制靶mRNA的翻譯［1］。microRNA在調控細胞的發育、分化、增殖與凋亡等方面都起著非常重要的作用［2］。研究［3－4］表明microRNA在臨床常見類型的白血病發病過程中起重要調控作用。前期報道［5］一個新的microRNA（microRNA-3666），靶向調控白血病細胞中PTEN蛋白的表達，可能在白血病發生發展過程中起重要作用。microRNA-1271在白血病細胞中的調控作用及其直接調控的靶基因至今仍然缺乏報道。該研究擬初步檢測microRNA-1271在白血病細胞中的表達水平，并進一步觀察microRNA-1271對白血病細胞中CYLD基因的調控作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑RPMI-1640培養基、DMEM培養基、熱滅活的胎牛血清購自美國Gibco公司；脂質體Lipofectamine 3000、TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；Amaxa核轉染試劑盒（kit V）購自德國Amaxa Biosystems公司；Hsa-microRNA-1271及內參U6 （RNU6B）特異性引物、microRNA逆轉錄試劑盒、SYBR Green實時熒光定量PCR試劑盒均購自德國Qiagen公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒、psi-CHECK-2雙熒光素酶報告基因質粒DNA均購自美國Promega公司。

1.2 細胞培養K562（人慢性髓原白血病細胞系）、NK-92、Jurkat細胞采用RPMI-1640培養基和10%胎牛血清培養，HEK293A（人胚腎細胞株）采用DMEM培養基和10%胎牛血清培養，以上細胞系均購自上海細胞庫。原代白血病細胞的分離來自于白血病患者的外周血，人外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）的分離來自于健康人外周血。

1.3 方法

1.3.1 細胞總RNA提取及熒光定量PCR 目的細胞總RNA的提取依據TRIzol試劑說明書操作，按照microRNA逆轉錄試劑盒說明書操作進行細胞cDNA的合成，按照熒光定量PCR試劑盒說明書進行PCR擴增反應。應用2－ΔΔCt法進行相對定量分析。

1.3.2 microRNA寡核苷酸序列的合成 Hsa-microRNA-1271的成熟體序列（mimic）、Hsa-micro RNA-1271成熟體的反向互補序列，即microRNA-1271抑制物（anti-microRNA-1271），以及相應的microRNA陰性對照（anti-microRNA-NC）均由上海吉瑪公司設計合成。

1.3.3 載體構建 CYLD 3’UTR報告基因載體psi-CHECK-2-CYLD WT-3’UTR攜帶野生型（wild type，WT）的CYLD 3’UTR，而psi-CHECK-2-CYLD突變型（mutant）3’UTR則攜帶突變了microRNA-1271識別元件的3’UTR。兩個載體的構建均以雙熒光素酶報告基因質粒psi-CHECK-2為基礎，將野生型或突變型的CYLD 3’UTR序列插入psi-CHECK-2的多克隆位點，并通過測序鑒定載體構建的正確性。

1.3.4 報告基因活性檢測 HEK293A細胞鋪板，24 h后用Lipofectamine 3000進行轉染實驗。microRNA-1271 mimic或microRNA陰性對照（microRNA-NC）的濃度為20 nmol／L，重組雙熒光素酶報告基因質粒0.2 μg，共轉染HEK293A細胞，48 h后按實驗需要處理細胞。

1.3.5 核轉染 根據Kit V核轉染試劑盒說明書，采用第二代核轉染儀，程序設致為T-16，分別將anti-microRNA-1271及anti-microRNA-NC分別轉入K562白血病細胞系，20 h后收集細胞，并進行后續所需的相關實驗。

1.3.6 Western blot法檢測K562 細胞去除培養基，加入適量的蛋白裂解液，提取蛋白，BCA法進行蛋白定量。10%SDS-PAGE凝膠，恒壓電泳，恒流200 mA轉膜2 h，室溫封閉1 h，加入CYLD一抗，4℃孵育過夜，加入二抗，室溫孵育l h，化學發光法檢測分析結果。

1.4 統計學處理采用SPSS 15.0軟件進行分析，數據以±s表示。組間差異采用單因素方差分析或t檢驗。

2 結果

2.1 白血病細胞中microRNA-1271的表達qRTPCR結果顯示，在人白血病細胞系以及急性髓細胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）、慢性髓細胞白血病（chronic myelogenous leukemia，CML）、急性淋巴細胞白血病（acute lymphocytic leukemia，ALL）等3種原代白血病細胞中，microRNA-1271的表達均明顯高于正常人PBMC。見圖1。

2.2 Targetscan在線分析軟件預測microRNA-1271的潛在靶基因通過Targetscan在線分析軟件（www.targetscan.org），將microRNA名稱Hsa-microRNA-1271輸入檢索框中，點擊submit，系統預測出microRNA-1271的可能的靶基因。顯示在CYLD 的3′UTR上含有一段與microRNA-1271的結合位點（種子序列）。見圖2。

2.3 microRNA-1271對CYLD基因3′UTR的調控將microRNA-1271的mimic和攜帶CYLD 3’UTR的報告基因載體（3’WT UTR或3’mutant UTR）共轉染HEK293A細胞，結果顯示轉染3’WT UTR野生型載體的細胞熒光素酶活性顯著下調，而轉染3’mutant UTR突變型載體的細胞熒光素酶活性未見變化。提示microRNA-1271能特異性作用于CYLD的3’UTR區域。見圖3。

2.4 microRNA-1271抑制物轉染K562細胞后CYLD表達變化研究顯示轉染anti-micro RNA-1271組，下調microRNA-1271的表達后，K562細胞中CYLD蛋白水平明顯上調（圖4）。

3 討論

microRNA在包括白血病在內的多種惡性腫瘤中發揮著重要作用［6－9］。因此，microRNA的功能研究對惡性腫瘤的臨床診斷和治療具有重要價值。而microRNA主要通過直接調控其下游特異性靶基因的表達發揮其生物學功能［10－11］，因此，microRNA靶基因的尋找及鑒定是研究其生物學功能的關鍵。

研究［12－13］報道microRNA-1271在某些實體瘤中具有重要的生物學功能，本研究為了探討microRNA-1271在白血病中的作用，首先檢測了microRNA-1271在多種白血病細胞系以及分離的原代白血病細胞中的表達情況，研究顯示microRNA-1271在白血病細胞中高表達。為了進一步探討microRNA-1271在白血病細胞中的重要作用，通過生物信息學軟件預測分析microRNA-1271的靶基因，并首次證明CYLD是microRNA-1271的直接功能性靶基因。CYLD是2003年發現的具有去泛素化酶活性的抑癌基因。研究［14］顯示，在多種實體瘤中存在CYLD基因的突變或低表達。近來研究［15］表明，CYLD基因在白血病中存在不同程度的缺失或突變。本實驗結果表明，在白血病細胞中，下調microRNA-1271后，CYLD蛋白的表達水平顯著上調。

綜上所述，microRNA-1271可通過靶向CYLD基因，調控其蛋白表達水平，進而可能影響白血病細胞的惡性生物學行為，研究結果為進一步完善白血病發生發展的調控機制提供了基礎，也為白血病的治療提供了可能的新靶點。

［1］ Bartel D P.MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，and function［J］.Cell，2004，116（2）：281－97.

［2］ Cheng A M，Byrom M W，Shelton J，et al.Antisense inhibition of human microRNAs and indications for an involvement of microRNA in cell growth and apoptosis［J］.Nucleic Acids Res，2005，33（4）：1290－7.

［3］ Khalaj M，Tavakkoli M，Stranahan A W，et al.Pathogenic microRNA′s in myeloid malignancies［J］.Front Genet，2014，5：361.

［4］ Bottoni A，Calin G A.MicroRNAs as main players in the pathogenesis of chronic lymphocytic leukemia［J］.Microrna，2014，2 （3）：158－64.

［5］ 倪 芳，趙 華，汪心怡，等.MicroRNA-3666調節白血病細胞PTEN基因的表達［J］.中國病理生理雜志，2014，36（4）：615－9.

［6］ Calin G A，Ferracin M，Cimmino A，et al.A microRNA signature associated with prognosis and progression in chronic lymphocytic leukemia［J］.N Engl J Med，2005，353（17）：1793－801.

［7］ Garzon R，Volinia S，Liu C G，et al.MicroRNA signatures associated with cytogenetics and prognosis in acute myeloid leukemia ［J］.Blood，2008，111（6）：3183－9.

［8］ Garzon R，Garofalo M，Martelli M P，et al.Distinctive microRNA signature of acute myeloid leukemia bearing cytoplasmic mutated nucleophosmin［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105（10）：3945－50.

［9］ Zhu D X，Miao K R，Fang C，et al.Aberrant microRNA expression in Chinese patients with chronic lymphocytic leukemia［J］. Leuk Res，2011，35（6）：730－4.

［10］Carthew R W，Sontheimer E J.Origins and mechanisms of microRNAs and siRNAs［J］.Cell，2009，136（4）：642－55.

［11］Ambros V.The functions of animal microRNAs［J］.Nature，2004，431（7006）：350－5.

［12］Yang M，Shan X，Zhou X，et al.microRNA-1271 regulates cisplatin resistance of human gastric cancer cell lines by targeting IGF1R，IRS1，mTOR，and BCL2［J］.Anticancer Agents Med Chem，2014，14（6）：884－91.

［13］Maurel M，Jalvy S，Ladeiro Y，et al.A functional screening identifies five microRNAs controlling glypican-3：role of microRNA-1271 down-regulation in hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology，2013，57（1）：195－204.

［14］Massoumi R.CYLD：a deubiquitination enzyme with multiple roles in cancer［J］.Future Oncol，2011，7（2）：285－97.

［15］Ye H，Liu X，Lv M，et al.MicroRNA and transcription factor coregulatory network analysis reveals miR-19 inhibits CYLD in T-cell acute lymphoblastic leukemia［J］.Nucleic Acids Res，2012，40 （12）：5201－14.

microRNA-1271 regulates the expression of CYLD in leukemia cells

Zhang Qian，Wang Yuanyuan，Liu Liping，et al
（Dept of Pharmacy，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601）

ObjectiveTo explore the regulatory effect of microRNA-1271 on the expression of its target gene CYLD in leukemia cells.MethodsmicroRNA-1271 expression levels in normal peripheral blood mononuclear cells（PBMC）and leukemia cells were determined by quantitative real-time PCR.microRNA-1271 targeting CYLD 3′-UTR was predicted by TargetScan.3′-UTR of CYLD was inserted into the dual luciferase reporter vector psi-CHECK2. The reporter activity was evaluated by the dual Luciferase Reporter Assay System after the luciferase promoter vector and microRNA were co-transferred into the HEK293A cell line.K562 cell lines were transfected with microRNA-1271 inhibitors（anti-microRNA-1271）or a negative control microRNA（anti-microRNA-NC），the expression of CYLD protein in the above transfected K562 cells were determined by Western blot.ResultsmicroRNA-1271 was up-regulated in human leukemia cell lines and primary leukemia cells compared to normal human PBMCs.The results of dual luciferase assays validate CYLD as a specific target gene of microRNA-1271.Inhibition of microRNA-1271 resulted in the upregulation of CYLD protein expression in K562 cell line.ConclusionmicroRNA-1271 is overexpressed in leukemia cells，the microRNA-1271 abnormal overexpression may play a key role in leukemia due to the down-regulation of CYLD.

leukemia；microRNA；microRNA-1271；CYLD

R 363

A

1000－1492（2015）07－0908－04

2015－03－13接收

國家自然科學基金青年項目（編號：31300715）；安徽省自然科學基金青年項目（編號：1308085QH136）

1安徽醫科大學第二附屬醫院藥劑科，合肥 230601

2安徽醫科大學基礎醫學院，合肥 230032

張 茜，女，主管藥師；倪 芳，女，副教授，責任作者，E-mail：nifang1203＠126. com