小鼠骨髓源性樹突狀細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)體系的構(gòu)建

劉振明，胡何節(jié)，方征東，王曉天，孫小杰，葛新寶

◇技術(shù)與方法◇

小鼠骨髓源性樹突狀細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)體系的構(gòu)建

劉振明，胡何節(jié)，方征東，王曉天，孫小杰，葛新寶

建立一種體外誘導(dǎo)培養(yǎng)小鼠骨髓源性的樹突狀細(xì)胞（DCs）方法，在鏡下可觀察到培養(yǎng)出的未成熟樹突狀細(xì)胞（imDCs）比成熟樹突狀細(xì)胞（mDCs）細(xì)胞突起少。流式細(xì)胞術(shù)檢測CD80、CD86、MHC-Ⅱ分子在imDCs的表達(dá)顯著低于在mDCs上的表達(dá)。同種異基因混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)顯示DCs刺激T細(xì)胞增殖的能力隨著DCs所占比例的增大而增強(qiáng)，在相同比例條件下對刺激T細(xì)胞增殖的能力，imDCs顯著低于成熟mDCs。該誘導(dǎo)方法可獲得大量符合科研要求的小鼠骨髓源性DCs。

小鼠；樹突狀細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)

目前的研究［1］認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的發(fā)生、發(fā)展到轉(zhuǎn)歸是一種慢性炎癥反應(yīng)的病理過程，有大量的免疫細(xì)胞和炎癥介質(zhì)參與其中。樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）作為目前已知的體內(nèi)功能最強(qiáng)的專職抗原提呈細(xì)胞（antigen－presenting cell，APC），也是唯一能在體內(nèi)直接激活初始T細(xì)胞的抗原提呈細(xì)胞，其在誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞活化，刺激初始T淋巴細(xì)胞增殖、介導(dǎo)免疫耐受等方面發(fā)揮著重要作用［2］。該研究通過提取小鼠骨髓細(xì)胞體外培養(yǎng)DCs，旨在為后續(xù)其在AS小鼠模型上進(jìn)行其免疫功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性C57BL／6小鼠和BALB／c小鼠，6～8周齡，約20 g，清潔級，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 主要試劑 南美胎牛血清（fetal calf serum，F(xiàn)CS）購自美國Hyclone公司；RPMI 1640全培養(yǎng)液購自美國Gibco公司；重組小鼠粒細(xì)胞－巨噬細(xì)胞集落刺激因子（recombinantmurine granulocyte macrophage colony stimulating factor，rmGM-CSF）及重組小鼠白介素-4（recombinant murine interleukin-4，rm IL-4）購自美國Peprotech公司；脂多糖（lipopdysaccharide，LPS）及甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）購自美國Sigma公司；小鼠流式單克隆抗體FITC-CD11c、PE-CD80、PE-CD86、PEMHC-Ⅱ及其同型對照抗體購自美國eBioscience公司。

1.1.3 主要儀器 流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；Thermo恒溫培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司；酶標(biāo)儀購自美國BioTek公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠骨髓源性DCs的分離、培養(yǎng)及誘導(dǎo)將C57BL／6小鼠頸椎脫臼法處死，無菌條件下取出雙側(cè)股骨、脛骨，仔細(xì)剝離附著的肌肉組織，用PBS反復(fù)洗滌，無菌剪刀剪去骨干兩端，1 ml注射器抽取RPMI 1640全培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔直至變白，沖洗液經(jīng)400目濾網(wǎng)過濾去除組織碎片，收集細(xì)胞懸液至15 m l離心管中，以1 200 r／min離心5 min，去除上清液，用含12%FCS的RPMI 1640全培養(yǎng)液配成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5 ×105／ml，加入rmGM-CSF（終濃度20 ng／m l）及rm IL-4（終濃度20 ng／ml），分裝于培養(yǎng)瓶，置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后收集懸浮細(xì)胞，1 200 r／min離心5 min，去除上清液，補(bǔ)充含12% FCS的RPMI 1640全培養(yǎng)液及rmGM-CSF、rm IL-4細(xì)胞因子，以后隔日半量換液，第5天將收集的懸浮細(xì)胞分成兩組，一組在培養(yǎng)液中加入LPS（1μg／ml）刺激成熟，培養(yǎng)至第7天收集懸浮細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測其表面共刺激分子的表達(dá)，另一組不做LPS刺激處理，培養(yǎng)至第7天收集懸浮細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測其表面共刺激分子的表達(dá)。

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 倒置顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察DCs的形態(tài)及數(shù)量的變化并攝影記錄。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測DCs表面分子 分別收集兩組細(xì)胞離心后去上清液，將約4×105個(gè)DCs懸于300μl PBS，按照流式抗體說明書進(jìn)行抗體標(biāo)記及同型對照標(biāo)記，4℃避光孵育30 min，加1 m l PBS洗滌離心，重懸于300μl PBS中，流式檢測兩組細(xì)胞表面CD80、CD86、MHC-Ⅱ的表達(dá)情況。

1.2.4 MTT法檢測同種異基因混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（mixed lymphocyte reaction，MLR） 頸椎脫臼法處死BALB／c小鼠，無菌條件下取出其脾臟，剪碎研磨經(jīng)400目濾網(wǎng)過濾，得到細(xì)胞懸液，用淋巴細(xì)胞分離液分離出單核細(xì)胞，尼龍毛柱法獲得同種異體T細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞，調(diào)整密度為2×106／ml。取上述方法獲得的C57BL／6小鼠骨髓性未成熟樹突狀細(xì)胞（immature dendritic cells，imDCs）和成熟樹突狀細(xì)胞（mature dendritic cells，mDCs），加入終濃度為25μg／ml的絲裂霉素C，37℃孵育45 min，PBS洗滌2遍，按照DC∶T細(xì)胞比例為1∶5、1∶10、1∶20、1∶40的反應(yīng)比鋪于96孔板中，每個(gè)比例設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，設(shè)單純的DC細(xì)胞和單純T細(xì)胞為陰性對照組，設(shè)培養(yǎng)液為空白對照組，在37℃、5% CO2條件下共培養(yǎng)72 h，共培養(yǎng)結(jié)束前4 h，在每孔中加入20μl MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔吸取培養(yǎng)液后加入150μl的DMSO，室溫震蕩10min，酶標(biāo)儀測定各孔的吸光度（absorbance，A）值，檢測波長為570 nm。刺激指數(shù)（stimulation index，SI）＝（待測樣品孔A值－培養(yǎng)液對照組A值）／（陰性對照組A值－培養(yǎng)液對照組A值）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)以±s表示。

2 結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察DCs的形態(tài)及數(shù)量的變化倒置顯微鏡下可見細(xì)胞在開始的48 h內(nèi)呈貼壁生長，細(xì)胞體積較小，有少量的細(xì)胞聚集現(xiàn)象。培養(yǎng)48 h后，部分細(xì)胞開始出現(xiàn)半懸浮狀態(tài)，并形成細(xì)胞集落，少量細(xì)胞表面出現(xiàn)毛刺狀突起。培養(yǎng)的第5天鏡下觀察可見大量細(xì)胞集落，細(xì)胞集落表面可見大量長短不一的突起，細(xì)胞體積進(jìn)一步增大，呈懸浮狀態(tài)。加入LPS刺激48 h后，可見大量毛刺狀突起的DCs從集落釋放出來，呈游離狀態(tài)，而未加LPS刺激的DCs仍呈集落聚集生長。見圖1。

2.2 流式檢測DCs表面分子細(xì)胞培養(yǎng)第7天分別收集兩組細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)分析其表面分子的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，兩組細(xì)胞均高表達(dá)CD11c分子，純度＞90%。未加LPS刺激組的DCs低表達(dá)CD80、CD86、MHC-Ⅱ分子，細(xì)胞表現(xiàn)為未成熟狀態(tài)，而在LPS刺激組這些表面分子則呈現(xiàn)出明顯的高表達(dá)，細(xì)胞表現(xiàn)為成熟狀態(tài)。見圖2。

2.3 M TT法測兩組DCs對同種異基因T細(xì)胞的刺激增殖能力單因素析因方差分析結(jié)果顯示兩組DCs刺激T細(xì)胞增殖的能力隨著DCs所占比例的增大而增強(qiáng)，在相同比例條件下，imDCs刺激T細(xì)胞增殖的能力顯著低于mDCs刺激T細(xì)胞增殖的能力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 M LR中im DCs和mDCs對T細(xì)胞的SI

表1 M LR中im DCs和mDCs對T細(xì)胞的SI

組別n DC∶T細(xì)胞比例1∶5 1∶10 1∶20 1∶40 F值P值imDCs 3 1.38±0.04 1.29±0.02 1.16±0.04 1.04±0.06 39.243 0.000 mDCs 3 2.35±0.07 1.95±0.05 1.43±0.02 1.31±0.11 149.699 0.000 F值504.0 410.2 129.3 14.8 P值0.000 0.000 0.000 0.020

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用Lutz et al［3］創(chuàng)建的小鼠骨髓性DCs培養(yǎng)方法，利用細(xì)胞的懸浮性能去除貼壁的單核細(xì)胞，收集培養(yǎng)液中的懸浮細(xì)胞，可篩選出高純度的DCs。對于誘導(dǎo)體系所采用的細(xì)胞因子濃度，不同的文獻(xiàn)報(bào)道差異較大，本實(shí)驗(yàn)在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，在rmGM-CSF濃度為20 ng／ml時(shí)DCs即可有比較滿意的獲得率，隨著細(xì)胞因子濃度的增加，DCs的獲得率并沒有明顯增加，而當(dāng)rmGM-CSF濃度達(dá)到100 ng／ml時(shí)，imDCs培養(yǎng)體系中imDCs所占的比例反而減少，mDCs所占比例增加，該結(jié)果與先前的文獻(xiàn)［4－5］報(bào)道一致。

DCs通過不同的成熟狀態(tài)改變細(xì)胞表面分子的表達(dá)及細(xì)胞因子的分泌，調(diào)節(jié)抗原特異性T細(xì)胞向不同亞群分化，參與免疫應(yīng)答和免疫耐受的發(fā)生。其免疫原性和耐受性雙重功能主要與其表達(dá)共刺激分子相關(guān)，在免疫應(yīng)答過程中，APC將抗原提呈給T淋巴細(xì)胞需要兩個(gè)信號(hào)的參與，第一信號(hào)由APC表面的抗原肽-MHCII類分子復(fù)合物與TCR相互作用，誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的活化，第二信號(hào)則是由CD80、CD86等協(xié)同刺激分子共同調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的增殖活化［6］。本研究顯示，imDCs組中CD80、CD86等協(xié)同刺激分子和MHC-Ⅱ類分子呈現(xiàn)出低表達(dá)，抗原提呈能力較弱，T淋巴細(xì)胞活化信號(hào)受阻，此時(shí)的DCs表現(xiàn)為免疫耐受狀態(tài)，而在mDCs組中CD80、CD86等協(xié)同刺激分子和MHC-Ⅱ類分子表達(dá)明顯升高，MLR實(shí)驗(yàn)顯示，mDCs對同種異基因的T細(xì)胞刺激能力明顯高于imDCs。刺激成熟后的DCs調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的活化，參與機(jī)體免疫應(yīng)答，而未刺激成熟的DCs在體內(nèi)下調(diào)免疫應(yīng)答和維持免疫耐受，又稱之為耐受性樹突狀細(xì)胞（tolerogenic dendritic cells，tolDCs）。本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞形態(tài)、分子表達(dá)和MLR三個(gè)方面鑒定培養(yǎng)體系中imDCs和mDCs的形態(tài)和功能特點(diǎn)，可以判定培養(yǎng)出的DCs符合科研要求。

有文獻(xiàn)［7］報(bào)道，盡管在人和老鼠的正常動(dòng)脈上也能發(fā)現(xiàn)DCs，但當(dāng)這些血管發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化時(shí)，DCs在數(shù)量和分布上會(huì)發(fā)生很大的改變。本課題組的前期研究［8］顯示，在人頸動(dòng)脈粥樣硬化血管中免疫原性的CD83＋mDCs的分布增多，而耐受性的CD11b＋tolDCs分布減少。由此可見，DCs的免疫調(diào)節(jié)作用參與了AS的發(fā)生和發(fā)展，然而DCs在體內(nèi)的數(shù)量較少，僅占外周單核細(xì)胞的1%左右［9］，如此稀少的數(shù)量給其免疫功能的研究帶來了不小的困難。因此，本實(shí)驗(yàn)利用rmGM-CSF及rm IL-4從小鼠骨髓細(xì)胞中誘導(dǎo)培養(yǎng)出大量可供研究的DCs，為后續(xù)在AS小鼠模型上進(jìn)行其免疫功能研究創(chuàng)造了有利的條件。

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A culture system for dendritic cells induced from murine bonemarrow in vitro

Liu Zhenming，Hu Hejie，F(xiàn)ang Zhengdong，et al
（Dept of General Surgery，The Affiliated Provincial Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230001）

To establish a culture system for dendritic cells（DCs）induced from murine bonemarrow in vitro.Compared with mature DCs，fewer spines were observed in immature DCs under microscopy.The expressions of cell surfacemolecules in immature DCswere significantly lower than those ofmature DCs.MLR indicated T cells proliferation capacities of same-reaction ratio in immature DCs were significantly lower than those in mature DCs.The methods of culturing DCs establised by us can be used in the future experment.

mice；dendritic cells；cell culture

R 654.3

A

1000－1492（2015）08－1177－04

2015－04－14接收

安徽省自然科學(xué)基金（編號(hào)：1208085MH151、1408085MH177）

安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院普通外科，合肥 230001

劉振明，男，碩士研究生；

胡何節(jié)，男，主任醫(yī)師，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：huhejie＠hotmail.com