非家族性青年三陰性乳腺癌與BRCA1基因突變的關系

劉曉丹，許文婷，楊 亮，吳 濤，王 斌，吐魯洪·沙吾列，趙 倩，迪力夏提·金斯汗，朱麗萍

非家族性青年三陰性乳腺癌與BRCA1基因突變的關系

劉曉丹，許文婷，楊 亮，吳 濤，王 斌，吐魯洪·沙吾列，趙 倩，迪力夏提·金斯汗，朱麗萍

目的探討非家族性青年三陰性乳腺癌（TNBC）與BRCA1基因突變的關系以及突變者與未突變者的臨床病理組織特征的差別。方法應用PCR擴增聯合DNA直接測序法檢測新疆地區50例非家族性青年TNBC患者BRCA1基因突變情況，同時對比分析突變者與未突變者的臨床病理組織特征。結果①50例非家族性青年TNBC患者BRCA1突變率為26%（13／50），其中漢族高于少數民族（27.6%vs 23.8%），但差異無統計學意義（χ2＝1.599）。②50例非家族性青年TNBC患者中發現13例BRCA1突變的12個位點，其中4個為新發現的位點；2個BRCA1基因突變“熱點”；③50例非家族性青年TNBC BRCA1突變者與未突變者相比，腋窩淋巴結轉移率高（69.2%vs35.1%），TNM分期晚（77%vs37.8%），差異均有統計學意義（P＜0.05）。結論新疆地區非家族性青年TNBC患者BRCA1基因突變率高；212＋1G＞T和2077G＞A可能為新疆地區非家族性青年TNBC患者遺傳易感位點，尚需擴大樣本進一步研究；突變者與未突變者相比，存在臨床病理組織差異。

BRCA1基因；突變；非家族性；青年女性；三陰性乳腺癌；臨床病理特征

BRCA1基因是重要的抑癌基因，其結構和功能的異常與乳腺癌的發生密切相關［1］。研究［2］表明，BRCA1基因具有顯性遺傳特性，約45%的家族性乳腺癌中檢測出BRCA1基因突變。近年來，隨著乳腺癌發病率的增加，發病年齡日趨年輕化，青年乳腺癌在臨床上已不少見。三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）因受體均為陰性，治療手段較單一，療效不佳。這類乳腺癌侵襲性高，組織學分級較高，局部復發和全身轉移快，死亡率高［3］。青年TNBC患者預后較差。近年來國內外對于家族性及青年性乳腺癌已有報道，但對于非家族性青年TNBC鮮有報道，因此主要以新疆地區非家族性青年TNBC患者（≤40歲）為研究對象，分析BRCA1突變情況，探討BRCA1與非家族性青年TNBC的關系。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集2012年4月～2014年1月新疆醫科大學附屬腫瘤醫院乳腺外科收治的經病理確診、符合TNBC標準的青年女性乳腺癌患者50例，其中漢族29例，少數民族21例；患者發病年齡26～40歲，中位發病年齡34歲。均首次診斷為原發性乳腺癌，既往無其他腫瘤史，無化療、放療史，排除妊娠期、哺乳期乳腺癌。按BRCA1基因突變與否分為BRCA1基因突變組（n＝13）與BRCA1基因未突變組（n＝37），獲得知情同意后抽取外周靜脈血，置入5.0 ml含EDTA-K2抗凝的真空采血管中，放入－80℃冰箱中保存。該研究已獲得新疆醫科大學附屬腫瘤醫院倫理委員會批準，入組患者均已簽署BRCA1基因檢測知情同意書。

1.2 主要試劑與器材血液基因組DNA提取系統（非離心柱型）、Super Pure dNTPMix、Pfu DNA Polymerase（北京天根公司）；Marker DL2000、6×Loading Buffer（大連TaKaRa公司）；瓊脂糖、50×TAE（上海生工公司）；核酸蛋白定量儀（北京凱奧公司）；臺式離心機（上海安亭科學儀器制造廠）；電泳儀電源、電泳槽（北京市六一儀器廠）；梯度PCR儀（美國Bio-Rad公司）；凝膠成像系統（美國UVP公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 基因組DNA提取 使用血液基因組DNA提取系統按試劑盒說明提取DNA，電泳、保存。

1.3.2 PCR擴增 PCR反應體系：dNTPMix（10 mmol／L）0.6μl，10×Pfu Buffer 3μl，Primer F（10 μmol／L）0.6μl，Template 0.6μl，Primer R（10 μmol／L）0.6μl，Pfu DNA Polymerase 0.3μl，ddH2O224.3μl，相對應的DNA為50 ng，總反應體系為30 μl。PCR程序：95℃5 min，95℃30 s，退火溫度30 s，72℃60 s，40個循環，然后72℃延伸5 min，4℃保存，引物序列和退火溫度見表1。

1.3.3 直接測序與分析 將PCR擴增產物5μl在2.0%瓊脂糖凝膠電泳為單一亮條帶，取目的片段送至烏魯木齊歐易生物醫學科技有限公司進行正反雙向測序，將測序結果與GenBank中的BRCA1標準序列（NM＿007300.3）進行比對，判斷有無基因突變，再將突變的位點在乳腺癌信息中心網站數據庫（breast cancer information core，BIC）上作對照，判定是致病性突變位點、核苷酸多態性位點還是新發現的突變位點。根據HUGO推薦的規則對堿基插入和丟失進行命名。

表1 部分PCR引物序列和退火溫度

1.4 雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（p rogesterone recep tor）、人表皮生長因子受體（hum an epiderm al grow th factor-2，HER-2）檢測方法及結果判定使用PV9000法對患者進行ER、PR和HER-2表達的檢測。ER、PR以細胞核內有棕色顆粒者視為陽性細胞，著色陽性細胞數＞10%視為陽性；Her-2以＞10%細胞膜出現連續性的棕黃色表達視為陽性，10%～30%為（＋），31%～50%為（＋＋），＞50%為（＋＋＋）。對于HER-2（＋＋）者再行熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）法檢測確定HER-2基因擴增情況。ER、PR、HER-2均為陰性則定義為TNBC，其中任何一項陽性則定義為非TNBC［4］。

1.5 統計學處理采用SPSS 17.0統計軟件進行分析，計量資料以±s表示，計數資料以n或%表示，組間率的比較采用χ2檢驗，危險因素采用二項Logistic回歸分析，對各項參數進行賦值。

2 結果

2.1 BRCA1基因突變檢測對本組50例非家族性青年TNBC患者BRCA1基因突變進行檢測，共發現13例BRCA1突變的12個位點，突變率26%（13／50），包括5例致病性突變（FS、NS）和9例意義不明突變（MS、SP）；其中2個BRCA1基因突變“熱點”：5號外顯子第212＋1基因拼接點區G＞T和10號外顯子2077G＞A；突變位點中有4個位點在BIC中未有報道，為新發現的位點。見表2。非家族性青年TNBC患者BRCA1突變率漢族高于少數民族（27.6%vs23.8%），但差異無統計學意義（χ2＝1.599）。

2.2 BRCA1基因突變臨床病理特征本組50例新疆非家族性青年TNBC中，BRCA1基因突變組腋窩淋巴結轉移率高于BRCA1基因未突變組（69.2%vs 35.1%），差異有統計學意義（χ2＝4.539，P＜0.05）。BRCA1基因突變組較BRCA1基因未突變組在TNMⅢ、Ⅳ期比例高（77%vs 37.8%），差異有統計學意義（χ2＝8.596，P＜0.05）。BRCA1基因突變組與BRCA1基因未突變組在民族、病理類型、組織學分級、腫瘤大小以及Ki-67之間差異均無統計學意義。見表3。

2.3 BRCA1基因突變組免疫組化及臨床病理分期的Logistic回歸分析新疆地區50例非家族性青年TNBC患者中13例BRCA1突變組乳腺癌的Logistic分析結果顯示：Ki-67＞14%、組織學分化較差、淋巴結轉移、浸潤性導管癌、TNM分期較晚（Ⅲ、Ⅳ期）的患者發生BRCA1突變的概率分別是Ki-67≤14%、組織學分化較好、淋巴結未轉移、非浸潤性導管癌、TNM分期較早（Ⅰ、Ⅱ期）患者的2.800、2.183、4.154、0.521、5.476倍。見表4、5。

表2 50例非家族性青年TNBC患者BRCA1突變檢測結果

表3 臨床病理特征比較［n（%）］

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發病率逐年上升，在部分大城市已成為女性惡性腫瘤之首位，發病年齡也逐漸年輕化［5］。據國外文獻［6］報道，青年乳腺癌占全部乳腺癌的15%～25%。BRCA1基因是與乳腺癌發病高度相關的腫瘤抑癌基因，在高危人群（家族性乳腺癌、TNBC、早發性乳腺癌、雙側乳腺癌等）中BRCA1突變率較高，國內外關于家族性乳腺癌與BRCA1的報道已很多。

表4 觀察參數統計賦值表

表5 13例非家族性青年TNBC患者BRCA1基因突變免疫組化及臨床病理分期的Logistic回歸分析

本研究以50例非家族性青年TNBC患者為研究對象，其BRCA1的突變率為26%（13／50）。國外文獻［7］報道，不同的研究人群TNBC中BRCA1突變率約11%～38%。而丁曉曼等［8］檢測北京地區10例早發性乳腺癌BRCA1突變率為10%。本研究與國外同類報道［7］基本一致，高于國內同類報道［8］，提示本研究BRCA1基因突變可能與新疆地區非家族性青年TNBC患者密切相關。其中漢族患者BRCA1基因突變率高于少數民族，但差異無統計學意義。本研究中5例BRCA1致病性突變：3例移碼突變3294delT、2952delT、2073delA和1例無義突變2394C＞T均位于Exon10，1例移碼突變5533＿5540del位于Exon 24。此外發現的9例意義不明突變中5例位于Exon10，2例位于Introns16，2例位于Exon5；其中13號標本Exon10上發現了3個突變位點。本研究顯示BRCA1突變大多位于Exon10，這相關文獻［9－10］報道基本一致。同時發現2個BRCA1基因突變“熱點”：212＋1G＞T位于Exon5，2077G＞A位于Exon10，可能為新疆地區遺傳易感位點，尚需擴大樣本進一步研究。突變位點中有4個位點（3294delT、2941C＞G、2939T＞A、2073delA均位于Exon10）在BIC中未有報道，為新發現的位點，豐富了中國BRCA1突變攜帶譜。這些突變可能與新疆地區非家族性青年TNBC患者的地域或種族不同有關系。

本研究中的13例非家族性青年TNBC患者BRCA1基因突變組病理類型多為浸潤性導管癌，僅3例髓樣癌，與BRCA1基因未突變組相比差異無統計學意義；且組織學分級兩組相比差異也無統計學意義，但BRCA1基因突變組青年TNBC患者腋窩淋巴結轉移率高，TNM分期晚。這與Levanat et al［11］報道的BRCA1基因突變相關性乳腺癌具有髓樣癌及Luminal A亞型比例高、腫瘤細胞分級高等特點不同。而與劉秀蘭等［12］報道的結果相一致。BRCA1基因突變者與BRCA1基因未突變者相比，存在臨床病理組織差異，應考慮個體化治療。

本研究通過非條件Logistic回歸發現乳腺癌病理和免疫組化特點對BRCA1的突變有影響：Ki-67＞14%、組織學分化較差、淋巴結轉移、TNM分期較晚（Ⅲ、Ⅳ期）是BRCA1突變的危險因素。本研究表明，可以通過病理檢測腫瘤分化程度和病理免疫組化法來預測BRCA1突變的概率。BRCA1的研究對乳腺癌的病因、預防、診斷和治療提供有力的支持，但本次研究樣本量較少，尚需繼續擴大樣本量進一步研究。

［1］ Narod S A，Salmena L.BRCA1 and BRCA2 mutations and breast cancer［J］.Discov Med，2011，12（66）：445－53.

［2］ Irminger-Finger I，Siegel B D，leung W C.The functions of breast cancer susceptibility gene1（BRCA1）product and its associated proteins［J］.Biol Chem，1999，380（2）：117－28.

［3］ Cleator S，HellerW，Coombes R C.Trip le-negative breast cancer：therapeutic options［J］.Lancet Oncol，2007，8（3）：235－44.

［4］ 王穎芳，李智賢，曾 健，等.三陰性乳腺癌超聲表現及臨床、病理特征［J］.中國醫學影像技術，2011，27（1）：87－90.

［5］ 孔 薇，李海燕，牟曉陽，等.乳腺癌組織學分級下目標基因提取及轉錄調控網絡構建［J］.安徽醫科大學學報，2014，49（10）：1365－70.

［6］ El-Zaemey S，Nagi N，Fritschi L，et al.Breast cancer among Yemeniwomen using the National Oncology Centre Registry 2004－2010［J］.Cancer Epidemiol，2012，36（3）：249－53.

［7］ Kwon JS，Gutierrez-Barrera A M，Young D，et al.Expanding the criteria for BRCA mutation testing in breast cancer survivors［J］.J Clin Oncol，2010，28（27）：4214－20.

［8］ 丁曉曼，郎景和.BRCA1基因在早發性乳腺癌中的突變［J］.中華醫學雜志，2000，80（2）：111－3.

［9］ 劉軍杰，陳圓圓，李智賢，等.廣西地區散發性乳腺癌BRCA1突變及其相關臨床、組織病理特征的研究［J］.廣西醫科大學學報，2013，30（4）：496－9.

［10］Young S R，Pilarski R T，Donenberg T，et al.The prevalence of BRCA1 mutations among young women with triple-negative breast cancer［J］.BMCCancer，2009，9：86.

［11］Levanat S，Cvok M L.Molecular basis of breast cancer related to BRCA1 and BRCA2 genes：characteristics and targeting therapy［J］.Lijec Vjesn，2010，132（1－2）：34－7.

［12］劉秀蘭，陳世杰.41例青年乳腺癌臨床病理學特征分析［J］.吉林醫學，2012，33（1）：50－2.

The relationship between non-fam ilial young trip le negative breast cancer and BRCA1 mutations

Liu Xiaodan，Xu Wenting，Yang Liang，et al
（Dept of Surgery of Breast，The Affiliated Tumor Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830011）

Objective To explore the relationship between non-familial young triple negative breast cancer（TNBC）and BRCA1 gene mutation and discuss the difference of clinical and pathological features between patients with BRCA 1 genemutation and without it.MethodsBRCA 1 genemutationsof5 0 casesnon-familialyoung TNBCpatients were detected by PCR-DNA sequencing in Xinjiang region.Clinical and pathological features were compared and analyzed between patients with BRCA1 gene mutation and without it.Results①The prevalence of BRCA1 mutations in 50 non-familial young TNBC caseswas26%（13／50），which Han is higher than ethnicminorities（27.6%vs23.8%），but the difference was not statistically significant（χ2＝1.599）.②13 cases of BRCA1 mutationswith 12 loci in 50 cases of non-familial young TNBC patients were found，4 of which were new loci；2 BRCA1 genemutation“hot spots”were found.③Compared with no BRCA1 mutation patients，BRCA1 mutation patients in 50 cases of non-familial young TNBC had higher rate of axillary lymph node metastasis（69.2%vs 35.1%），and later rate of TNM stage（77%vs37.8%），the differences were statistically significant（P＜0.05）. Conclusion The prevalence of BRCA1 mutations in patientswith non-familial young TNBC is higher inmulti-ethnic region of Xinjiang.212＋1G＞T and 2077G＞A may be genetic susceptible spot in non-familial young TNBC in Xinjiang region，and requiremore samples to confirm the results.Differences exist in clinical and pathological features between patients with BRCA1 genemutation and without of it.

BRCA1 genes；mutation；non-familial；young women；TNBC；clinical pathological features

R 737.9

A

1000－1492（2015）08－1168－05

2015－03－24接收

新疆維吾爾自治區自然科學基金（編號：2012211A031）

新疆醫科大學附屬腫瘤醫院乳腺外科，烏魯木齊 830011

劉曉丹，女，碩士研究生；

朱麗萍，女，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：zlp＿1005＠sina.com