骨橋蛋白在SLE腎損害Th17細胞異常中的作用

羅妙旋，米向斌，張堂德，邱賢文，張亞杰

骨橋蛋白在SLE腎損害Th17細胞異常中的作用

羅妙旋1，米向斌1，張堂德1，邱賢文1，張亞杰2

目的探討骨橋蛋白（OPN）在系統性紅斑狼瘡（SLE）腎損害患者Th17細胞異常中的作用。方法取40例健康者和50例SLE患者（其中，伴腎損害SLE患者25例、無腎損害的SLE患者25例的血清和肝素鈉抗凝血，用ELISA法檢測血清中OPN和白介素-17（IL-17）的表達水平，用流式細胞術檢測外周血中CD3＋CD8－IL-17A＋T細胞的陽性率，并分析各組間差異，以及各因素間的相互關系。結果①SLE腎損害患者組的OPN、IL-17水平和CD3＋CD8－IL-17A＋T細胞陽性率顯著高于無腎損害的SLE患者組、健康對照組，差異均有統計學意義（P＜0.01）；無腎損害的SLE患者組和健康對照組間OPN、IL-17、CD3＋CD8－IL-17A＋T細胞陽性率的差異均無統計學意義（P＞0.05）。②血清中OPN分泌與IL-17水平、CD3＋CD8－IL-17A＋T細胞陽性率之間均成明顯正相關性（P＜0.01）。結論外周血中的OPN對SLE腎損害患者的Th17細胞異常起著重要的調控作用。

系統性紅斑狼瘡；骨橋蛋白；Th17細胞

系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種常見的累及多系統、多器官的自身免疫性疾病。細胞因子分泌和復雜調控網絡的異常是SLE免疫紊亂發生和各系統、器官的慢性炎癥及器官損害的直接原因［1］。輔助性T細胞17（T helper cell 17，Th17細胞），通過其主要效應分子白介素（interleukin，IL）-17對SLE靶器官炎癥反應的增強作用，進而促進了靶器官的炎性損傷和SLE的發生發展［2］。特別是SLE腎損害患者中，Th17細胞異常活化并且過度分泌IL-17起著重要作用［3］。但是，SLE腎損害Th17細胞異常活化和分泌IL-17的確切機制還不完全清楚。近來的研究［4］顯示，骨橋蛋白（osteopontin，OPN）作為Th17細胞異常活化和炎性因子分泌的重要調控器，在SLE疾病發生和靶器官炎性損傷中，特別是SLE腎損害中起著重要作用。現通過ELISA法研究伴腎損害SLE患者、無腎損害的SLE患者和健康人血清中OPN和IL-17分泌水平、外周血中CD3＋CD8－IL-17A＋T細胞陽性率的差異及相互關系，探討OPN在SLE，特別是腎損害患者中Th17細胞過度活化和表達IL-17增強中的調控作用。

1 材料與方法

1.1 病例資料共收集50例SLE患者，全部符合美國風濕學會的SLE診斷標準（1997年修訂）。其中，臨床出現蛋白尿者為SLE腎損害患者，反之為無腎損害的SLE患者。SLE腎損害患者共25例，女23例，男2例，年齡13～57（29.56±12.11）歲；無腎損害的SLE患者25例，女22例，男3例，年齡15～77（32.36±14.31）歲；健康對照40例，均為南方醫科大學珠江醫院體檢中心健康體檢者，無自身免疫性疾病家族史，女37例，男3例，年齡18～54（28.47±13.84）歲。各組的性別和年齡構成的差異均無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 主要儀器與試劑實驗所需儀器由中山大學孫逸仙醫院林百欣醫學研究中心提供：多動能酶標儀（美國Molecule Device公司，SpectraMax M5）；流式細胞分析儀（美國BD公司，FACSVerse）。人OPN、IL-17因子ELISA試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）；Th17細胞檢測試劑盒（杭州聯科生物技術有限公司）；CD3、CD8抗體、IL-17A抗體、IgG1（美國eBioscience公司）。

1.3 方法

1.3.1 用ELISA法檢測血清中OPN、IL-17水平

收集無抗凝全血3～4 m l，4℃過夜后于4℃、3 000 r／min離心10 min，取上清液于－20℃保存；操作步驟按照產品說明書嚴格進行。取450、540 nm波長處的光密度值之差值為實際光密度值。制作其標準曲線并計算出最終的樣本濃度。

1.3.2 用流式細胞術檢測外周血中CD3＋CD8－IL-17A＋T細胞的陽性率 用肝素鈉抗凝管采集靜脈血1～2 m l，室溫放置，4 h內檢測。基本步驟如下：取250μl全血標本，用RPMI 1640等體積稀釋到500μl；在標本中加入刺激劑佛波酯PMA（250×）2 μl和阻斷劑BFA（250×）2μl；37℃、5%CO2培養箱培養4～6 h，期間相隔1～2 h混勻1次；設置檢測樣品管1和對照管2，分別加入100μl培養好的全血，以及CD3、CD8抗體，4℃避光孵育30 min；加入破膜劑100μl，室溫孵育15 min；加入3 ml染色緩沖液，1 500 r／min離心5 min棄上清液收集細胞；渦旋，加入固定液100μl，檢測樣品管1中加入IL-17A抗體，對照管2中加入同型對照鼠IgG1，室溫孵育20min；加入3m l染色緩沖液，1 500 r／min離心5 min，棄上清液收集細胞；用0.5 m l PBS重懸后立即上機檢測CD3＋CD8－IL-17A＋T細胞的陽性率。

1.4 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件進行分析。采用One-Way ANOVA方差分析及其兩兩比較方法分析各組間細胞因子及CD3＋CD8－IL-17A＋T細胞陽性率的差異。采用Pearson線性相關分析法分析各因素間相關關系。

2 結果

2.1 伴腎損害的SLE患者血清中OPN水平均顯著升高與健康對照組、無腎損害SLE組相比，伴腎損害SLE組外周血血清中OPN水平明顯增高，差異均有統計學意義（F＝42.032，P＜0.01）；無腎損害的SLE患者組與健康對照組相比，血清中OPN水平差異無統計學意義（F＝42.032，P＞0.05）。見表1。

表1 各組血清OPN、IL-17水平和外周血CD3＋CD8－IL-17A＋T細胞陽性率

表1 各組血清OPN、IL-17水平和外周血CD3＋CD8－IL-17A＋T細胞陽性率

與伴腎損害SLE組比較：**P＜0.01

檢測指標伴腎損害SLE組（n＝25）無腎損害SLE組（n＝25）健康對照組（n＝40）OPN（pg／m l）44.70±23.46 15.66±11.27**13.31±5.96**IL-17（pg／ml）164.47±128.62 52.61±28.41**37.98±26.37**CD3＋CD8－IL-17A＋T細胞（%）1.89±1.09 37.98±26.37**0.29±0.14**

2.2 伴腎損害的SLE患者血清中IL-17水平均顯著升高與健康對照組、無腎損害的SLE組相比，伴腎損害的SLE組外周血血清中IL-17水平明顯增高，差異均有統計學意義（F＝25.768，P＜0.01）；無腎損害的SLE患者組與健康對照組相比，血清中IL-17水平差異無統計學意義（F＝25.768，P＞0.05）。見表1。

2.3 伴腎損害的SLE患者外周血中CD3＋CD8－IL-17A＋T細胞的陽性率顯著升高伴腎損害的SLE患者外周血中CD3＋CD8－IL-17A＋T細胞的陽性率較健康對照組、無腎損害的SLE患者均明顯增高（F＝58.878，P＜0.01）；無腎損害的SLE患者外周血中CD3＋CD8－IL-17A＋T細胞的陽性率與健康對照組間差異無統計學意義（F＝58.878，P＞0.05）。見表1、圖1。

2.4 血清中OPN與IL-17以及CD3＋CD8－IL-17A＋T細胞陽性率的相關性血清中OPN與IL-17水平、CD3＋CD8－IL-17A＋T細胞陽性率之間均成明顯正相關性（r＝0.442、0.630，P＜0.01）。

3 討論

SLE是一種以多種炎性細胞因子參與的多靶器官損害為特征的自身免疫性疾病。特別是SLE腎損害，免疫復合物形成、免疫細胞和細胞因子等免疫異常導致的靶器官細胞浸潤和炎性損傷是其發病的關鍵因素。Th17細胞及其分泌的多種炎性細胞因子在SLE疾病的免疫紊亂及器官的炎性損傷中有非常重要的作用［5］。有學者發現SLE患者外周血及受累器官Th17細胞及IL-17均高表達。而且在SLE活動期其表達更高，而經過治療后其表達有所降低［6］。不僅SLE患者IL-17的分泌增加和分泌IL-17的CD4＋、CD3＋CD4－CD8－T細胞增多，而且分泌IL-17的Th17細胞也存在于SLE患者炎性損傷的腎組織中［7］。本研究顯示，SLE腎損害患者外周血CD3＋CD8－IL-17A＋T細胞的陽性率及血清中IL-17水平較無腎損害SLE患者組、健康對照組均顯著升高。但是，無腎損害SLE患者組、健康對照組間外周血CD3＋CD8－IL-17A＋T細胞的陽性率及血清中IL-17水平無明顯差異。這些結果均提示Th17細胞和其主要效應分子IL-17可能通過促進炎細胞向靶器官的遷移，導致SLE受累器官的炎性損傷，特別是腎臟的炎性損傷，最終導致SLE的發生發展。

另一方面，OPN是由活化的T細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞表達的一種多效性細胞因子，正常情況下表達甚微，但是在炎癥期間可以大量表達［8］。近年來的研究［9］表明，OPN表達不僅可以增強Th1型免疫反應并抑制Th2細胞因子的表達，還可以通過對IL-17介導的自身免疫性炎癥的調控，導致自身免疫性疾病中靶器官的炎性損傷。研究［10］顯示OPN與多發性硬化癥、類風濕性關節炎和SLE等自身免疫性疾病密切相關。不僅SLE患者血清中OPN分泌明顯增加，而且OPN分泌和SLE病情活動程度評分呈明顯正相關性［11］。同時，研究［12］顯示，OPN在SLE腎損害中發揮重要作用［12］。本研究結果顯示，SLE腎損害患者血清中OPN水平比無腎損害SLE患者和健康對照者明顯增高，但是無腎損害SLE患者和健康對照間OPN水平無明顯差異。而且，血清OPN水平與CD3＋CD8－IL-17A＋T細胞的陽性率及血清中IL-17水平均呈明顯正相關性。這些結果說明，OPN的產生和SLE的疾病進展和腎臟炎性損傷密切相關。

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The role of osteopontin in abnormal Th17 cell in SLE patientsw ith renal damage

Luo Miaoxuan，Mi Xiangbin，Zhang Tangde，et al
（Dept of Dermatology，Zhujiang Hospital of Southern Medical University，Guangzhou 510282）

Objective To investigate the regulatory role of osteopontin（OPN）in abnormal Th17 cells of systemic lupus erythematosus（SLE）patients.MethodsThe levels of OPN and interleukin-17（IL-17）in serum and the rate of CD3＋CD8－IL-17A＋T cell from 40 healthy controls and 50 SLE patients（25 SLE patientswith renal damage and 25 SLE patients without renal damage）were detected by ELISA and flow cytometry methods.Besides，difference between groups and interaction amongmultiple elements were analyzed.Results①The levels of OPN and IL-17 in serum，the rate of CD3＋CD8－IL-17A＋T cell in SLE patients with renal damage all obviously increased than SLE patientswithout renal damage and healthy controls（P＜0.01），while there was no differencebetween SLE patients without renal damage and healthy controls（P＞0.05）.②Meanwhile，significant positive correlation was shown between serum OPN and serum IL-17 level，CD3＋CD8－IL-17A＋T cell（P＜0.01）.ConclusionOPN plays an important regulatory role in abnormal Th17 cells of SLE patients with renal damage.

systemic lupus erythematosus；osteopontin；Th17 cell

R 593.24

A

1000－1492（2015）08－1165－04

2015－04－29接收

國家自然科學基金（編號：81201233、81000291）

1南方醫科大學珠江醫院皮膚科，廣州 510280；

2廣州醫科大學附屬第二醫院腎內科，廣州 510260

羅妙旋，女，碩士研究生；

米向斌，女，博士，主治醫師，責任作者，E-mail：mitaiyang＠163.com