清髓性不含抗胸腺細胞球蛋白方案的非血緣臍血移植后免疫重建與巨細胞病毒感染情況分析

李桂芳，汪麗鈺，孫光宇，湯寶林，朱小玉，童 娟，鄭昌成，姚 雯，張 磊，薛 磊，皖 湘，宋闿迪，強 萍，張旭晗，劉會蘭，孫自敏

清髓性不含抗胸腺細胞球蛋白方案的非血緣臍血移植后免疫重建與巨細胞病毒感染情況分析

李桂芳，汪麗鈺，孫光宇，湯寶林，朱小玉，童 娟，鄭昌成，姚 雯，張 磊，薛 磊，皖 湘，宋闿迪，強 萍，張旭晗，劉會蘭，孫自敏

目的探討清髓性不含抗胸腺細胞球蛋白（ATG）方案的非血緣臍血移植（UCBT）后巨細胞病毒（CMV）感染（血癥）的發病情況。方法回顧性分析100例接受清髓性不含ATG方案的UCBT患者移植后CMV血癥及CMV病發生情況，同時初步分析UCBT后受者早期淋巴細胞重建情況。結果UCBT后受者外周血CMV拷貝數＞10／ml發生率為92.7%，血CMV拷貝數＞103／m l發生率為75.3%；中位發生時間為42 d。CMV病發生率為1.03%。CMV轉陰的中位時間為94 d。UCBT后淋巴細胞持續穩定上升，中位CD3＋CD8＋T細胞及CD3＋CD4＋T細胞分別于移植后2個月及5個月達正常范圍。結論清髓性不含ATG方案的UCBT后T細胞免疫重建相對較快，CMV血癥發生率高，但CMV病發生率較低。

巨細胞病毒感染；臍血移植；預處理方案；免疫重建

異基因造血干細胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）已成為治療惡性血液病、某些遺傳性疾病及先天性免疫缺陷病的有效方法。allo-HSCT后受者均存在免疫缺陷期，因受者淋巴細胞及其亞群的恢復在抵御移植后感染特別是病毒和真菌感染方面起決定性作用，因此巨細胞病毒（cytomegalovirus，CMV）感染是移植后最常見的并發癥之一［1］，其易感因素主要有：接受CMV血清陽性供者的造血干細胞的CMV血清陰性受者；接受環孢素、激素等免疫抑制劑治療的患者；接受二次移植的患者［2］。CMV感染可導致CMV間質性肺炎、CMV性腸炎、CMV性肝炎等CMV病，若不及時治療，死亡率可達90%以上［3］，其感染率和發病率的高低是評價移植預處理方案優劣的良好指標。

由于臍血具有移植后嚴重的移植物抗宿主?。╣raft-versus-host disease，GVHD）發生率低和移植物抗白血病作用強的優勢，非血緣臍血越來越多地用作無同胞人類白細胞抗原相合供體的患者進行allo-HSCT的移植物供源。臍血移植（umbilical cord blood transplantation，UCBT）后免疫重建（immune reconstitution，IR）特別是T細胞及其亞群重建明顯延緩，所以早期感染相對死亡率增加。對該研究采用不含抗胸腺細胞球蛋白（antithymocyte globulin，ATG）清髓性方案的UCBT治療惡性血液病100例，探討該方案UCBT后受者CMV的感染和發病情況，并分析UCBT后受者淋巴細胞、T細胞和NK細胞等免疫細胞的早期重建情況，初步分析UCBT后早期IR與CMV感染及CMV病發生的可能內在聯系。

1 材料與方法

1.1 病例資料回顧性分析2012年1月～2014年6月在安徽醫科大學附屬省立醫院血液科行UCBT的100例患者的臨床資料，其中男58例，女42例；年齡1.5～51歲，中位年齡13歲；體重12～90 kg，中位體重45 kg?；颊咴l病為慢性粒細胞白血病5例，急性淋巴細胞白血病57例，急性髓細胞白血病31例，急性混合細胞白血病1例，骨髓增生異常綜合征4例，惡性淋巴瘤2例。進行移植的供受者均在移植前進行CMV抗體（IgG及IgM）檢測，移植前受者血清CMV-IgM均為陰性，CMV-IgG陽性90例，陰性10例；臍血供者血清CMV-IgG及IgM均為陰性。移植前供受者血CMV-DNA均為陰性。

1.2 方法

1.2.1 移植預處理方案 方案包括：①分次全身照射＋環磷酰胺＋阿糖胞苷＋重組粒細胞集落刺激因子，而不加用以免疫抑制為主的藥物ATG，本研究有54例使用該方案；②考慮全身照射有影響生長發育等毒副作用，對于生長發育期兒童采用經典BUCY2方案聯合阿糖胞苷或氟達拉濱的方案，加用氟達拉濱（22例）或阿糖胞苷（24例）進一步增強抗白血病作用，并增加對受者的免疫抑制而促進植入。

1.2.2 GVHD的預防 環孢素A＋霉酚酸酯方案預防GVHD，環孢素A移植前1 d始3 mg／（kg· d），持續24 h靜脈滴注。發生急性GVHD，維持環孢素A有效濃度并加用甲基潑尼松龍0.5～2.0 mg／（kg·d）；對肝臟GVHD改環孢素A為他克莫司口服，根據GVHD的嚴重度調整免疫抑制劑的療程和用量；對于激素難治性GVHD，及時加用巴利昔單抗－舒萊及臍帶間充質干細胞等二線免疫抑制藥治療。

1.2.3 CMV感染預防與監測 所有患者于移植后第1天開始給予阿昔洛韋注射液總量10 mg／kg，每日分2次靜注。移植后1個月改為阿昔洛韋口服直至3個月，造血重建后開始每周2次，移植后2～6個月每周1次行血清CMV-DNA檢查，出現血清CMV-DNA拷貝數＞103／ml給予更昔洛韋或者膦甲酸鈉靜脈滴注，直至CMV-DNA轉陰后劑量減半維持治療1～2周。

1.2.4 CMV-DNA的檢測 EDTA抗凝血4℃靜置后吸取上層血清50μl，加等量DNA提取液吹打均勻，100℃保溫10 min，12 000 r／min離心5 min，取上清液為病毒DNA樣本。取DNA樣本5μl，6 000 r／min離心1 min后置于定量PCR儀器的孔樣品槽內，按對應順序設置陰性質控品、陽性質控參考品梯度（104～108拷貝數／ml）以及未知標本，每批實驗均設標準曲線，同時應滿足標準曲線的回歸系數r＞0.97和陰性參照無擴增曲線，否則實驗無效。循環條件：93℃預變性2min；然后93℃5 s，55℃60 s，先做10個循環，最后按93℃30 s，55℃45 s，30個循環結束。試劑盒（YZB／國0257-2011）購自中山大學達安基因股份有限公司。

1.2.5 UCBT后T、NK細胞檢測方法 通過4色流式細胞術動態檢測UCBT后1～6、9、12個月受者T及NK細胞重建動力學變化，對移植后不同時間點受者外周血單個核細胞表面標記進行檢測，熒光單克隆抗體標記淋巴細胞亞型包括T淋巴細胞（CD3＋、CD4＋、CD8＋）和NK細胞（CD3－CD16＋CD56＋）。用FACSCalibur流式細胞分析儀檢測，然后用CellQuest software（BD Biosciences）分析。用淋巴細胞射門，確定下列細胞亞型：CD3－CD16＋CD56＋（NK細胞）、CD3＋（總T細胞）、CD3＋CD4＋（輔助T細胞）、CD3＋CD8＋（細胞毒T細胞）亞型。每個亞型根據光散射和前側向散射的特征及以上單克隆抗體識別的表面抗原的表達來分析。

1.2.6 UCBT后CMV血癥和CMV病的診斷 根據臨床表現可將CMV感染分為CMV血癥和CMV病，診斷標準參考Xuan et al［4］研究，CMV血癥：有CMV病原學證據［CMV-DNA檢測陽性和（或）CMV血清學顯示CMV-IgG、IgM均陽性］但無CMV感染癥狀；CMV病：不明原因發熱，伴或不伴白細胞總數下降50%，有CMV病原學證據及病毒損害臟器的組織病理學證據，如出現間質性肺炎、胃腸炎、肝炎、視網膜炎等器官、組織損害，需免疫組織化學證實或者組織活檢病理證實并排除其他病因。本研究中定義血CMV-DNA陽性，無論拷貝數多少，即為CMV感染發生。

2 結果

2.1 UCBT后造血重建及淋巴細胞、單核細胞的恢復情況UCBT后中位隨訪時間為18.5個月（4～33個月），其中隨訪12個月以上者46例。100例患者中，未植入3例，存活78例，中性粒細胞植入時間11～38 d，中位時間為19 d，血小板植入時間為16～192 d，中位時間為37 d。移植后1個月受者單核細胞絕對數（absolute monocyte count，AMC）及淋巴細胞絕對數（absolute lymphocyte count，ALC）開始快速持續升高，中位AMC于UCBT后1個月達正常范圍，AMC于UCBT后4～18個月均維持在較高水平；中位ALC于UCBT后2個月達正常范圍，以后穩定持續升高，見圖1。

2.2 UCBT后NK細胞和T細胞亞群的重建淋巴細胞中最快速重建的是NK細胞，其中位絕對數于UCBT后1個月達正常范圍。T淋巴細胞亞群在UCBT后也一直呈上升趨勢，CD3＋CD8＋T細胞上升最快，UCBT后2個月達正常范圍，4～12個月高于正常值上限，以后輕度回落到正常值范圍。CD3＋T細胞于UCBT后3個月達正常范圍，6～12個月略高于正常值上限。CD3＋CD4＋T細胞于UCBT后5個月達正常范圍，見圖2。

2.3 CMV血癥及CM V病發生率對97例獲得造血重建的患者進行回顧性分析顯示：90例（92.8%）發生CMV血癥（血清CMV-DNA拷貝數＞10／ml），其中UCBT后第1個月內CMV-DNA拷貝數＞10／ml者有39例（40.2%），CMV-DNA拷貝數＞103／ml者有8例（8.2%）；最早發生CMV血癥的時間為回輸后17 d，移植后60 d內CMV-DNA拷貝數＞10／ml者有73例（75.3%），CMV-DNA拷貝數＞103／ml者有49例（50.5%）；移植后90 d內CMV-DNA拷貝數＞10／ml者有50例（51.5%），CMV-DNA拷貝數＞103／ml者有12例（12.4%）；移植后120 d內CMV-DNA拷貝數＞10／m l者有23例（23.7%），CMV-DNA拷貝數＞103／m l者有4例（4.1%）?；剌斈氀杉毎?個月內CMV未感染者8例（8.2%），有1例明確診斷為CMV腦炎，腦脊液CMV-DNA陽性，抗病毒治療后有效，其他UCBT后發生肝損害、腸炎及肺炎等病例均未能明確診斷與CMV感染有關。

患者外周血CMV-DNA拷貝數＞10／ml的時間為17～109 d，中位時間為32 d，發生率為92.8%；患者外周血CMV-DNA拷貝數＞103／m l的時間為19～181 d，中位時間為42 d，發生率為75.3%；經過抗病毒治療后，患者外周血CMV轉陰的時間為34～226 d，中位時間為94 d，其中CMV轉陰時間超過120 d的患者均因發生GVHD而處于免疫抑制治療中。患者CMV累積再激活率曲線顯示，自移植后20 d開始出現感染，并呈逐漸上升趨勢，到移植后40～80 d曲線上升速度最快，之后逐漸變慢，120 d之后曲線將近平緩，見圖3。為分析移植后CD3＋CD8＋細胞毒T細胞的重建速度與血CMV感染發生率的關系，考慮到CMV感染發生的中位時間在移植后42 d，故分析移植后1個月外周血CD3＋CD8＋細胞毒T細胞數與CMV感染發生的關系顯示：移植后1個月CD3＋CD8＋T細胞的中位數作為界點（中位CD3＋CD8＋T細胞數為172／μl），將細胞數高于172／μl的患者與低于172／μl的患者CMV感染發生率進行比較，兩者差異無統計學意義（P＝0.98）。

3 討論

CMV感染及CMV病是造血干細胞移植患者術后最常見的機會性感染和最嚴重的移植并發癥之一；據報道［5］，在移植后的第1年里，超過50%的受者會有CMV原發感染或再激活的實驗室證據。本研究針對不含ATG的清髓性預處理的UCBT后患者的資料分析，顯示移植后患者CMV感染發生率高達92.8%（移植前血CMV-DNA陰性，移植后血CMV-DNA陽性），血CMV-DNA＞103拷貝數／ml發生率也高達75.3%，與研究［6］相似。研究［7］顯示，CMV感染在兒童中的發生率為91.7%，而CMV病發生率為19%，CMV病發生率明顯高于本研究。UCBT后高發生的CMV感染的可能原因主要有：①UCBT供者CMV血清學抗體均為陰性，而受者幾乎均為CMV血清學陽性；②輸注的UCBT中所含T淋巴細胞少且表型為初始（na?ve）型，移植物中缺少抗CMV特異性細胞毒T細胞（cytotoxic lymphayte，CTL）；③包含ATG的預處理方案進一步延緩了UCBT后IR。另外，清髓性預處理也可能延緩早期IR，增加CMV及EB病毒等感染率［4］。

研究［1，8－9］報道移植前供受者血清學狀態是移植后發生CMV感染的主要危險因素，供者CMV-IgG陰性，受者CMV-IgG陽性者CMV再激活率最高，死亡率也最高。最近研究［10］證實在清髓性預處理方案的非血緣allo-HSCT后，CMV血清學陽性受者接受CMV血清學陽性供者（與CMV陰性供者相比較）移植物可改進總生存率，而CMV血清學陰性受者接受CMV血清學陽性供者移植物可降低生存率。本研究由于臍血供體CMV血清學均為陰性，而移植受者血清學陽性率高達90%，所以UCBT后受者CMV再激活可能是CMV感染的一個主要原因。

移植物中所含有的CMV特異性CTL以及移植后由CMV抗原刺激和細胞因子驅動的na?ve T細胞轉變成的CMV特異性CTL是清髓性allo-HSCT后控制CMV感染的主要免疫細胞。采用人類白細胞抗原相合同胞供體移植時，當患者和供者allo-HSCT前CMV抗體均陽性，CMV-CTL的恢復快速，可達到所有CD8＋T細胞的21%；若供受者CMV抗體均為陰性，則CMV特異性CTL早期重建發生時間延遲。接受非血緣移植的患者與同胞移植患者比較，CMVCTL恢復推遲，allo-HSCT后100 d內沒有發現CMV-CTL產生［11－12］，由此可以推測UCBT后CMV發生率高可能與CMV-CTL重建延遲有關。研究［13］顯示盡管UCBT物中基本不含有CMV特異性CTL，但在UCBT后8周受者外周血中就能檢測到CMV特異性CTL，考慮為臍血na?ve T細胞在抗原刺激和細胞因子驅動下可轉變成CMV特異性CTL。然而這些CMV特異性CTL細胞的數量很有限、功能仍不完善，不能完全清除CMV血癥，受者只有在CD4＋CD45RA＋T細胞恢復后才能完全清除CMV血癥，這可能是由于本研究采用了含ATG的預處理方案，由于ATG較長的半衰期，抑制了移植后na?ve T細胞的外周擴增，進一步延緩了UCBT后T細胞重建。因為含ATG的方案的UCBT受者移植后T細胞包括CMV特異性CTL重建延緩，故含ATG方案的UCBT后CMV病發病率相對增高［13－14］。

本研究顯示CMV病發生率相對偏低，考慮與本中心采用了不含ATG的預處理方案有關，該方案UCBT后總淋巴細胞、單核細胞及NK細胞重建速度均較快，中位NK細胞絕對數于移植后1個月內即可達正常水平。本研究分析移植后1個月CD3＋CD8＋T細胞數與CMV感染發生的關系表明，UCBT后1個月CD3＋CD8＋T細胞數與CMV感染率差異無統計學意義，但未檢測CMV特異性CTL，可能是因為總CD3＋CD8＋T細胞數的重建不能完全反應CMV特異性CTL的重建。本研究組前期研究［15］顯示UCBT 4個月后受者外周血終末分化效應記憶T細胞比例明顯升高，也提示UCBT后T細胞在發揮著抗感染等效應功能。另外UCBT后密切監測CMV再激活，及時干預治療也是降低CMV病的一個主要因素。由于本研究對UCBT后發生肺炎、腸炎、肝炎等的病例未行脫落細胞及組織學相關CMV抗原檢測，也可能導致統計的CMV病發生率偏低。

由于UCBT獨特的特征（CMV血清學陰性、na?ve T細胞），UCBT后CMV感染及CMV病的發生高是影響UCBT成功的關鍵因素之一。在目前臨床上尚不能進行CMV特異性T細胞輸注的情況下，通過改進移植方案來加快UCBT后IR特別是CMV特異性T細胞的恢復是降低CMV病的一個重要措施，而采用不含ATG的方案是加快UCBT后IR的主要方法。本研究采用不含ATG的方案加快了UCBT后IR，UCBT后半年內密切監測CMV-DNA、及時進行干預治療，也是降低UCBT患者CMV發生率的重要措施。

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Analysis of immune reconstitution and the incidence of cytomegalovirus infection after unrelated cord blood transp lantation follow ing m yeloablative conditioning w ithout antithym ocyte globulin

Li Guifang，Wang Liyu，Sun Guangyu，et al
（Dept of Hematology，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001）

Objective To investigate the incidence of cytomegalovirus infection after unrelated cord blood transplantation（UCBT）following myeloablative conditioning without antithymocyte globulin（ATG）.MethodsThe data of100 patients，who underwent UCBT，were collected，and the incidences of CMV infection and CMV disease，as well as primary lymphocytes reconstitution were analyzed retrospectly.ResultsThe incidence of plasma CMV-DNA copies＞10／ml and＞103／ml in peripheral blood（PB）of patients after UCBT were 92.7%and 75.3%，respectively.Themedian time of plasma CMV-DNA copies＞103／m l in PB of patients after UCBTwas42 days.The incidence of CMV disease was1.03%.Themedian time for CMV clearance was 94 days.Lymphocytes counts steadily increased after UCBT and themedian count of CD3＋CD8＋T cells and CD3＋CD4＋T cells reached the normal level atmonth 2 and 5 after UCBT respectively.ConclusionThe immune reconstitution of T cell subset is relatively fastafter UCBT followingmyeloablative conditioning without ATG and the incidence of CMV viremia is high，but the incidence of CMV disease is low after this UCBT protocal.

cytomegalovirus infection；unrelated cord blood transplantation；conditioning regimen；immune reconstitution

R 512.93

A

1000－1492（2015）08－1128－05

2015－03－16接收

安徽省科技廳年度科研項目（編號：1301043028）；安徽省衛生廳醫學科研課題（編號：13zc018）

安徽醫科大學附屬省立醫院血液科，合肥 230001

李桂芳，女，碩士研究生；

劉會蘭，女，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：liuhuilan＠medmail.com.cn