白藜蘆醇對小鼠酒精性脂肪肝的防治作用及機制研究

陳 毅，胡成穆，唐麗英，李 浩，李 俊

白藜蘆醇對小鼠酒精性脂肪肝的防治作用及機制研究

陳 毅1，胡成穆1，唐麗英1，李 浩2，李 俊1

目的觀察白藜蘆醇（RSV）對Lieber-DeCarli酒精液體飼料誘導的小鼠酒精性脂肪肝的作用，并初步探討其可能的相關分子機制。方法6～8周齡雄性C57BL／6J小鼠隨機分為6組：正常對照組、模型組、RSV（10、30、100 mg／kg）組和谷胱甘肽（GSH，200 mg／kg）陽性對照組，造模的同時給予藥物干預共10 d，實驗結束后稱取體重，處死小鼠，收集血液和肝臟，分離血清測定相關指標，病理切片觀察肝臟的脂肪蓄積，免疫組化法檢測脂肪分化相關蛋白（ADRP）的表達，Western blot法檢測肝臟腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）及脂素（lipin1）的表達。結果與模型組比較，RSV組血清中谷丙轉氨酶（ALT）和谷草轉氨酶（AST）水平顯著降低（P＜0.01），但血清三酰甘油（TG）水平降低不明顯；肝臟TG（低劑量：P＜0.05，中、高劑量：P＜0.01）和丙二醛（MDA）含量顯著降低（P＜0.01），超氧化物歧化酶（SOD）活性顯著升高（P＜0.01）。病理組織學結果顯示RSV明顯減輕肝臟脂肪變性，免疫組化法結果顯示RSV能夠抑制ADRP的表達，Western blot法結果表明RSV能激活AMPK活性，增加其磷酸化水平，并能抑制lipin1蛋白的表達。結論RSV對小鼠酒精性脂肪肝具有一定的保護作用，其機制可能與激活AMPK-lipin1通路有關。

白藜蘆醇；酒精性脂肪肝；腺苷酸激活蛋白激酶；脂素

酒精性脂肪肝（alcoholic fatty liver，AFL）為長期大量飲酒所致的一種慢性肝病，在酒精性肝病中最為常見。常伴隨有肝細胞脂肪變性、肝細胞損傷及炎癥細胞浸潤，若繼續飲酒，可進一步發展為肝纖維化、肝硬化甚至肝癌［1］。目前尚無有效的治療藥物，因此尋找一個防治酒精性脂肪肝發生發展的藥物尤為重要。

白藜蘆醇（resveratrol，RSV）是一種廣泛存在于紅酒、葡萄、花生等一些植物中的膳食多酚。其具有廣泛的藥理作用，包括抗癌、抗氧化、抗炎、抗血管新生、保肝等作用。研究［2］表明，RSV通過去乙酰化酶1（sirtuin 1，SIRT1）－腺苷酸激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）途徑對酒精性肝脂肪變性有一定治療效果。在攝入酒精的小鼠肝臟，RSV通過提高SIRT1基因表達水平，激活AMPK活性，從而減少肝臟脂質積累。

脂素（lipin）是脂質代謝的關鍵調控因子。2001年Peterfy et al［3］利用定位克隆技術在肝臟脂質營養不良（fld）小鼠中發現了該突變基因，命名為lipin基因。lipin1在脂質代謝調節中具有雙向調控作用。一方面，lipin1作為三酰甘油合成所必須的一種磷脂酸磷酸酶（phosphatidic acid phosphatase，PAP），催化磷脂酸的去磷酸化，促進脂質的合成［4］；另一方面，lipin1作為一種轉錄協同刺激因子，與過氧化物酶體增生激活受體γ（peroxisome proliferator activated receptorγ，PPARγ）協同激活因子和PPARα共同促進脂肪酸的氧化［5］。近年來，對lipin1在肝臟脂質代謝的研究逐漸增加，有研究［6］表明，長期乙醇攝入會激活固醇調節元件結合蛋白-1（sterol regulatory element-binding proteins，SREBP-1），抑制AMPK活性，從而上調lipin1的表達，導致肝臟過多的脂質積累。該研究旨在觀察RSV對Lieber-De-Carli酒精液體飼料誘導的小鼠AFL的作用并探討相關的分子機制。

1 材料與方法

1.1 動物和飼料普通級雄性C57BL／6J小鼠共96只，購自安徽醫科大學實驗動物中心，6～8周齡，20～22 g，室溫22～25℃，相對濕度55%～60%。Lieber-DeCarli酒精液體飼料購自南通特洛菲飼料科技有限公司，RSV購自上海沃凱化學試劑有限公司。

1.2 小鼠AFL模型的建立及分組給藥造模過程包括Lieber-DeCarli液體飼料適應期（5 d）、造模期（10 d）、灌胃（1次）和取標本（1 d），總計16 d。小鼠隨機分為6組：①正常對照組：每天給予對照液體飼料（不含酒精）；②模型組：給予Lieber-DeCarli酒精液體飼料；③RSV 10mg／kg組；④RSV 30 mg／kg組；⑤RSV 100mg／kg組；⑥陽性對照組：還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH，200 mg／kg）。RSV灌胃給藥，GSH腹腔注射給藥，連續給藥10 d。各組小鼠造模期間每天觀察精神活動、反應能力、毛色等一般狀態。造模結束，第16天上午7～9時模型組酒精灌胃1次，對照組糊精灌胃，9 h后稱重麻醉采血，離心取血清，肝臟稱重后，分裝，計算肝指數（肝重／體重×100%）。部分肝臟用4%多聚甲醛固定，剩余保存于－80℃冰箱備用。

1.3 血清和肝組織相關指標檢測取血清按試劑盒說明書方法測定血清谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）和三酰甘油（triglyceride，TG）活性。用0.9%的生理鹽水制備10%肝勻漿，按試劑盒說明書方法測定肝勻漿上清液中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力及丙二醛（malondialdehyde，MDA）、TG含量。

1.4 肝組織HE染色取肝臟相同部分用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，HE染色，顯微鏡下觀察其病理變化。

1.5 免疫組化法檢測ADRP的表達將小鼠肝組織切片經3%H2O2溶液封閉及微波修復后，用ADRP抗體4℃孵育過夜，再經生物素標記的二抗處理后，滴加HRP，然后DAB染色，蘇木素復染，脫水、透明、封片。

1.6 W estern b lot法檢測肝臟AMPK、p-AM PK、Lipin1相關蛋白的表達用RIPA裂解液于冰上提取組織蛋白，BCA試劑盒測定各樣本蛋白濃度，蛋白煮沸變性后上樣，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，用濕性轉膜法將蛋白轉移至PVDF膜上。含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h后分別用一抗稀釋液稀釋的lipin1、p-AMPKα、AMPKα抗體4℃孵育過夜，洗膜3次，加入二抗稀釋液稀釋的辣根過氧化酶標記的二抗，室溫孵育2 h，洗膜3次后加入化學發光液，采用Image Quant LAS 4000 mini成像系統自動曝光。

1.7 統計學處理采用SPSS 17.0軟件進行分析，多組資料間比較采用方差分析。

2 結果

2.1 RSV對AFL小鼠體重和肝指數的影響造模前各組小鼠體重差異無統計學意義，造模結束后正常對照組小鼠體重自然增加，其它各組小鼠體重均有所減輕。模型組小鼠肝臟重量明顯高于對照組。與正常對照組比較，模型組肝指數明顯增加，肝臟指數在一定程度上可反映肝臟受損傷程度；RSV各用藥小鼠肝臟指數較模型組有所降低，但差異無統計學意義，見表1。

2.2 RSV對AFL小鼠肝組織外觀及病理改變的影響正常對照組小鼠肝臟無明顯的脂滴形成，肝小葉結構正常；模型組小鼠肝臟內彌漫大量脂肪變性，細胞中可見大小不等，分布不均的脂滴空泡，有輕微的炎性細胞浸潤。RSV（尤其是100 mg／kg）用藥后明顯減輕肝臟脂肪變性和炎性細胞浸潤，脂滴空泡明顯減少。見圖1。

2.3 RSV對AFL小鼠肝組織SOD、MDA和TG的影響與正常對照組比較，模型組AFL小鼠肝臟SOD的活性明顯降低，而MDA和TG的含量明顯升高；與模型組比較，RSV顯著降低AFL小鼠肝臟的MDA（F＝15.319，P＜0.01）和TG（F＝67.546，P＜0.01）水平，升高AFL小鼠肝臟SOD的活性（F＝8.351，P＜0.01），見圖2。

2.4 RSV對AFL小鼠血清ALT、AST和TG的影響模型組小鼠血清ALT、AST和TG水平明顯升高，RSV（30，100 mg／kg）降低AFL小鼠血清過高的ALT（F＝12.279，P＜0.01）、AST（F＝10.870，P＜0.01）水平。然而，與肝組織的TG水平有所不同，RSV對血清TG含量沒有顯著影響（F＝5.880，P＞0.05），見圖3。

2.5 RSV對AFL小鼠肝組織ADRP表達水平的影響ADRP主要定位于成熟脂肪細胞胞膜上，對照組只有少數肝細胞ADRP表達陽性，AFL模型組小鼠肝臟ADRP有較強表達，RSV各給藥組ADRP表達相對AFL模型組明顯減輕，見圖4。

表1 RSV對小鼠體重、肝重及肝指數的影響

表1 RSV對小鼠體重、肝重及肝指數的影響

與正常對照組比較：**P＜0.01

指標正常對照組模型組RSV給藥組（mg／kg ）10 30 100陽性對照組F值體重（g）23.90±1.92 21.06±1.70 18.88±1.68 18.56±1.45 18.95±1.77 18.55±2.08 16.122肝重（g）0.984±0.168 1.154±0.137 1.015±0.126 1.001±0.132 1.012±0.121 0.989±0.131 1.922肝指數（%）4.101±0.510 5.485±0.526**5.404±0.762 5.392±0.585 5.349±0.568 5.361±0.710 12.167

2.6 RSV對AFL小鼠肝臟AMPK、p-AMPK、lipin1蛋白表達的影響結果顯示模型組小鼠肝臟p-AMPK的水平顯著降低，而RSV用藥后p-AMPK蛋白的表達明顯增加（F＝34.236，P＜0.01），見圖5。

模型組小鼠肝臟lipin1蛋白表達增加，RSV用藥后其表達下調（F＝190.507，P＜0.01）。這些結果均表明，RSV對小鼠酒精性脂肪肝的保護作用，可能與其激活AMPK活性，抑制lipin1蛋白的表達有關，見圖6。

3 討論

長期大量乙醇攝入會導致肝細胞脂肪合成增加和脂質在肝細胞沉積，從而形成AFL。本實驗結果表明，乙醇促使小鼠肝指數增加，肝臟TG含量積聚，血清TG、ALT和AST的水平升高，肝細胞中過量脂滴形成和輕微的炎癥產生，從而導致肝細胞脂肪變性。研究［7］表明，RSV能夠減少小鼠肝臟中膽固醇和TG的積累，減少肝臟TG的合成。本實驗結果顯示，RSV通過降低血清ALT、AST的水平，減少肝臟脂質沉積，從而改善酒精性脂肪肝。然而，值得一提的是，本研究顯示RSV對血清TG含量無顯著影響。RSV對肝臟和血清TG含量影響差異的原因有待進一步研究。

脂肪分化相關蛋白（adipose differentiation-related protein，ADRP）在脂滴的合成和儲存中具有重要作用。因ADRP比HE染色更易發現肝細胞微小脂滴，可作為酒精性脂肪肝形成的標志［8］。免疫組化結果表明，模型組小鼠肝臟ADRP表達顯著增高，而RSV用藥后，可明顯降低表達過高的ADRP水平。表明RSV能夠抑制脂滴的形成，緩解肝臟脂質沉積。

氧化應激和脂質過氧化對AFL的發生和發展同樣起著重要作用。發生脂肪肝時，肝細胞內生成過多的活性氧（reactive oxygen，ROS），SOD的活性減弱，SOD反映了細胞清除ROS的能力。過多的ROS導致脂質過氧化，過量的自由基也使肝臟脂質過氧化增加，MDA生成增多，MDA能損傷細胞膜，影響細胞膜功能［9－10］。本研究表明，RSV顯著提升SOD活性，降低肝臟過高的MDA。因此，RSV對AFL的保護作用可能部分與其抗氧化作用有關。

AMPK作為能量代謝的關鍵調節因子，被喻為“細胞能量調節器”，其活化形式為Thr-172位磷酸化，AMPK也是AFL發病的關鍵信號分子。AMPK的活化能增加脂肪酸氧化，減少脂肪合成［11－12］。如前所述，lipin1是脂質合成中的PAP，不論在動物還是人的酒精性脂肪肝中，肝臟的PAP活性都顯著增加［13－14］，小鼠肝臟lipin1的缺失會加重酒精誘導的肝臟脂肪變性［15］。lipin1是AMPK介導的脂質代謝中一個重要的下游調節因子，AMPK-lipin1通路是AFL中的重要信號通路。乙醇抑制AMPK的活性，阻斷lipin1信號通路，導致AFL的發生和發展［6，16］。本實驗結果表明，乙醇顯著抑制AMPK的活性，促進AFL小鼠肝臟lipin1的表達。RSV可顯著提高AFL小鼠AMPK的磷酸化水平，下調lipin1的表達，改善AFL小鼠肝臟病變。這些結果表明RSV可能通過AMPK-lipin1信號通路發揮對AFL的保護作用。

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Protective effects and the potentialmechanism of resveratrol on alcoholic fatty liver in m ice

Chen Yi1，Hu Chengmu1，Tang Liying1，et al
（1School of Pharmacy，AnhuiMedical University，Hefei 230032；2Dept of Pharmacy，The Fourth Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230011）

Objective To evaluate the protective effectsof resveratrol（RSV）on alcoholic fatty liver（AFL）mice，and investigate the potentialmolecularmechanism.MethodsWe conducted vivo studies in C57BL／6Jmice fed with ethanol Lieber-DeCarli liquid dietand treated with RSV（10，30，100 mg／kg）and GSH（200 mg／kg）.ResultsThe results showed that RSV（30 or 100 mg／kg）treatment significantly attenuated hepatic steatosis with lowering activities of serum alanine aminotransferase（ALT），aspartate aminotransferase（AST）and levels of hepatic triglyceride（TG），increasing superoxide dismutase（SOD）activities，decreasingmalondialdehyde（MDA）content，although the levels of serum TG were not changed significantly.Immunohistochemistry analysis and HE staining showed that RSV suppressed the expression of adipose differentiation-related protein（ADRP）and reduced hepatic lipid accumulation.Western blot analysis showed that RSV stimulated AMP-activated protein kinase（AMPK）activity and inhibited lipin1 expression.ConclusionRSV has protective effects on alcoholic fatty liver，and the potentialmechanism mightbe involved in activation of AMPK-lipin1 signaling and its antioxidant roles.

resveratrol；alcoholic fatty liver；AMPK；lipin1

R 966；R 737.3；R 285.5

A

1000－1492（2015）08－1119－06

2015－04－14接收

安徽醫科大學博士科研經費資助計劃項目（編號：XJ201209）；安徽醫科大學校科學研究基金資助項目（編號：2012xkj092）

1安徽醫科大學藥學院，合肥 230032

2安徽醫科大學第四附屬醫院藥劑科，合肥 230032

陳 毅，男，碩士研究生；

李 俊，男，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：lijun＠ahmu.edu.cn