異氟烷預處理對腦缺血大鼠腦保護作用研究

邱 焱，董 斌，蔡曉嵐

異氟烷預處理對腦缺血大鼠腦保護作用研究

邱 焱1，董 斌2，蔡曉嵐1

目的研究異氟烷預處理局灶性腦缺血成年大鼠模型，通過檢測缺氧誘導因子1α（HIF-1α）、血紅素氧合酶1（HO-1）以及B細胞淋巴瘤因子2（Bcl-2）表達水平揭示其腦保護作用。方法2月齡SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、單純大腦中動脈閉塞模型組（MCAO組）、異氟烷預處理組（ISO組），缺血再灌注采用90 min大腦中動脈閉塞MCAO，MCAO之前ISO組進行30min異氟烷預處理，30min空氣洗脫。再灌注24 h檢測神經(jīng)功能評分及腦梗死面積，MCAO建模后再灌注6、24、72 h收集大鼠腦皮層組織，Western blot法檢測HIF-1α、HO-1以及Bcl-2表達水平。結(jié)果MCAO組術(shù)后24 h改良神經(jīng)損傷嚴重程度評分（mNSS評分）明顯低于ISO組（P＜0.05）。再灌注24 h檢測結(jié)果顯示，ISO組神經(jīng)損傷及腦梗死面積明顯小于MCAO組（P＜0.05）。建模6、24 h后MCAO組和ISO組HIF-1α、HO-1以及Bcl-2表達水平顯著上升（P＜0.05），24 h達到峰值，72 h時間點各指標與假手術(shù)組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)論ISO預處理通過上調(diào)HIF-1α、HO-1以及Bcl-2表達發(fā)揮腦保護作用，但非長效作用。

異氟烷；預處理；神經(jīng)保護；Bcl-2；缺氧誘導因子1α；血紅素氧合酶1

研究有效措施和藥物減少缺血性腦損傷是近年來醫(yī)學研究的一大熱點［1］。最初發(fā)現(xiàn)于大腦和心臟的預處理現(xiàn)象是可用于降低缺血性損傷的方法之一［2－3］。異氟烷（isoflurance，ISO）是臨床常用的揮發(fā)性麻醉劑，可誘導新生鼠和成年鼠腦的預處理效果［4］。ISO的預處理在圍手術(shù)期可降低腦卒中的發(fā)生率，在確保麻醉效果的同時最低程度影響患者腦功能。該研究通過大鼠動物模型神經(jīng)功能評分、腦梗死面積測定以及相關(guān)基因包括缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）、血紅素氧化酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）以及B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）的表達水平，初步揭示ISO腦保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組2月齡健康雄性SD大鼠購自中國醫(yī)科大學實驗動物部，280～300 g，隨機分為假手術(shù)組、異氟烷處理組（ISO組）和單純大腦中動脈閉塞模型組（MCAO組）。ISO組大鼠在90 min大腦中動脈閉塞MCAO建模前24 h暴露于2%ISO 30 min，操作方法參考文獻［5］報道。

1.2 揮發(fā)性麻醉藥預處理ISO預處理方法，通過氣管插管30 min，給予實驗動物吸入2%ISO進行誘導，由呼吸機控制通氣，保持正常呼氣末O2和CO2濃度。吸入和呼出氣體有德恩紅外分析儀檢測（Capnomac公司，芬蘭），麻醉期間肛溫保持（37± 0.2）℃。

1.3 MCAO動物模型制備大鼠稱重后，按3 m l／kg體重的劑量應(yīng)用10%水合氯醛腹腔麻醉，麻醉完成后，消毒頸部皮膚，頸正中切口，暴露頸總動脈、頸內(nèi)及頸外動脈，將頭端直徑0.38 mm尼龍線栓由頸外動脈殘端插入頸內(nèi)動脈，操作輕柔，遇阻力即刻停止，保證線栓插入深度18～20 mm，達到阻斷鼠大腦中動脈血流的目的。術(shù)中檢測大鼠肛溫、監(jiān)測心率及平均動脈壓，保證各項生理參數(shù)在正常范圍，線栓1.5 h后拔出。假手術(shù)組分離血管后不插入線栓即縫合。

1.4 神經(jīng)功能評分采用改良神經(jīng)損傷嚴重程度評分（modified neurological severity score，mNSS），評分包括動物感覺、反射、運動及平衡等綜合內(nèi)容，1～6分：輕度損傷；7～12分：中度損傷；13～18分：重度損傷，具體評分標準見表1。

2.2 各組大鼠缺血再灌注損傷后腦梗死面積比較

結(jié)合本人的工作經(jīng)驗以及和同事之間的探討，我們共同的感受就是“累”，從工作中所得甚少，不管是精神上還是心理上，只是感覺到了被壓榨和付出。心理上長期處于疲倦狀態(tài)，生理上也會在一定程度上處于疲倦狀態(tài)。

旅游者體驗鄉(xiāng)愁、留住鄉(xiāng)愁并享受鄉(xiāng)愁的一個重要方式是居住在其中，即鄉(xiāng)居，對其進行規(guī)范化管理尤其重要。20世紀60年代，法國度假別墅協(xié)會(Fédération des Gtes de France)成立，利用鄉(xiāng)村別墅認證制度——“Gte de France”對鄉(xiāng)居進行規(guī)范和管理。除根據(jù)內(nèi)外部環(huán)境、舒適程度和服務(wù)水平等三大方面進行評級，還用“麥穗”的個數(shù)來表示級別[13]。

缺血性腦損傷已成為當今高致殘和高致死率的神經(jīng)系統(tǒng)疾患，發(fā)生于心腦血管手術(shù)圍手術(shù)期的腦缺血影響患者術(shù)后的轉(zhuǎn)歸。越來越多的研究證實可吸入麻醉劑的預處理能降低缺血再灌注損傷，在一定程度上修復神經(jīng)功能，但目前ISO預處理的腦保護機制尚不明確［5－6］。本研究應(yīng)用SD大鼠建模后進行神經(jīng)功能損傷評估，mNSS評分結(jié)果顯示，ISO預處理組大鼠模型術(shù)后24 h評分明顯低于單純MCAO組，ISO組屬中度損傷，單純MCAO組mNSS評分顯示達到重度損傷。TCC染色結(jié)果顯示損傷后腦梗死面積對比，ISO組大鼠損傷后腦梗死面積較MCAO組明顯減少，這與mNSS評分改變相一致。

2.3.2 組間各指標比較結(jié)果 在6 h和24 h時，ISO組和MCAO組HIF-1α、HO-1和Bcl-2表達水平均顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05），其中24 h時間點處ISO組3個指標表達水平均明顯高于MCAO組（F＝12.171、11.450、11.136，P＜0.05）；在72 h時，3組間3個指標表達水平差異無統(tǒng)計學意義（F＝2.010、2.144、1.587，P＞0.05）。見圖2、表2。

2.3.1 組內(nèi)不同時間點比較結(jié)果 假手術(shù)組：HIF-1α、HO-1和Bcl-2表達水平在組內(nèi)各時間點比較差異均無統(tǒng)計學意義（F＝1.470、2.204、1.811，P＞0.05）。MCAO組和ISO組：HIF-1α、HO-1和Bcl-2表達水平在24 h時間點表達顯著上升，明顯高于6 h時間點，差異有統(tǒng)計學意義（F＝15.127、17.102、20.176，P＜0.05）。見表2。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能損傷程度評估MCAO建模成功大鼠56只，建模前大鼠mNSS評分均為0分，假手術(shù)組（20只）手術(shù)未見mNSS變化評分為0分，單純MCAO組（18只）術(shù)后24 h mNSS評分為（12.41± 3.78）分，ISO組（18只）術(shù)后mNSS評分為（9.271 ±1.94）分，組間差異有統(tǒng)計學意義（t＝2.136，P＜0.05）。

1.5 氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色法測定腦梗死面積24 h后大鼠水合氯醛腹腔麻醉后斷頭取腦，自視交叉前4 mm冠狀面起，向后連續(xù)切片，層厚2 mm，共取6片。切片置1%TTC染色液中，37℃避光孵育20 min，正常腦組織呈紅色，梗死區(qū)腦組織呈白色。

假手術(shù)組無腦梗死發(fā)生，ISO組大鼠損傷后腦梗死面積比率為（18.24±6.47）%，較單純MCAO組大鼠腦梗面積比率（35.18%±11.15）%明顯減少（t＝2.305，P＜0.05），見圖1。

2.3 大鼠腦皮層組織HIF-1α、HO-1以及Bcl-2表達水平

1.2.6 序列比對 參考序列數(shù)據(jù)來自UCSC Genome Browser(http:∥genome.ucsc.edu)數(shù)據(jù)庫，序列版本號：GRCh37/hg19。

1.7 統(tǒng)計學處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料采用表示，采用ANOVA方差分析比較組內(nèi)和組間差異，t檢驗比較各時間點兩組間的差異。

表2 HIF-1α、HO-1和Bcl-2不同時間點組間相對表達量s）

表2 HIF-1α、HO-1和Bcl-2不同時間點組間相對表達量s）

與同組6 h比較：*P＜0.05；與相同時間假手術(shù)組比較：＃P＜0.05；與相同時間MCAO組比較：△P＜0.05

項目假手術(shù)組MCAO組ISO組HIF-1α 6 h 0.22±0.09 0.35±0.12＃0.56±0.17△＃24 h 0.31±0.11 0.53±0.25*＃0.92±0.37*△＃72 h 0.27±0.08 0.30±0.11 0.30±0.12 HO-1 6 h 0.24±0.09 0.38±0.14＃0.59±0.08△＃24 h 0.25±0.10 0.68±0.29*＃0.96±0.37*△＃72 h 0.26±0.13 0.33±0.15 0.34±0.11 Bcl-2 6 h 0.30±0.09 0.43±0.13＃0.60±0.21△＃24 h 0.33±0.10 0.74±0.32*＃1.01±0.39*△＃72 h 0.35±0.12 0.38±0.14 0.34±0.13

3 討論

1.6 Westernblot檢測蛋白表達取梗死側(cè)腦組織，裂解，離心提取總蛋白，BCA法定量，取20μg樣本，上樣于SDS-PAGE凝膠，電泳結(jié)束后半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印蛋白至NC膜，5%脫脂奶粉4℃封閉2 h，一抗孵育過夜，洗膜后二抗孵育，洗膜后ECL發(fā)光。采用Image J凝膠圖像處理系統(tǒng)計算目的條帶與相應(yīng)內(nèi)參β-actin平均灰度值，根據(jù)目的條帶與內(nèi)參的灰度比值得出目的蛋白相對表達量。

實驗室是以專業(yè)為基礎(chǔ)，依托教研室建立起來的，實驗教學、實驗室人員主要由教研室管理。在這種體制下，各教研室各自為政，實驗室建設(shè)缺乏整體和全局意識，管理分散，實驗室建設(shè)力求小而全，使得實驗設(shè)備、儀器儀表、工具等重復購置。又由于儀器維修管理制度不全，導致儀器設(shè)備維修困難，進度緩慢，也造成了儀器設(shè)備共享障礙。

HIF-1α通過調(diào)節(jié)其靶基因如HO-1的表達在細胞存活、糖代謝以及代謝適應(yīng)中發(fā)揮作用［7－8］。研究［9］表明，七氟烷處理能介導HIF-1α上調(diào)，達到減少缺血后心血管損傷。轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)元中HO-1過表達在腦缺血損傷過程中發(fā)揮腦保護功能，HO-1通過自適應(yīng)機制發(fā)揮作用。HO-1可能通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)強效抗氧化膽色素發(fā)揮神經(jīng)保護功能，而HO-1潛在重要產(chǎn)物CO可促進微血管內(nèi)皮細胞形成。本研究顯示，經(jīng)ISO預處理組動物模型HIF-1α和HO-1蛋白表達水平均呈現(xiàn)上調(diào)，在6 h時間點，ISO組與單純MCAO組表現(xiàn)出差異，24 h時差異達到最大，至72 h組間無明顯差異。此結(jié)果提示ISO的預處理針對HIF-1α和HO-1蛋白表達的腦保護功能具有時效性，屬短時作用。

此外，預處理誘導神經(jīng)保護蛋白的激活作用可發(fā)生在預處理后的幾小時或幾天時間，而Bcl-2是被廣泛認可的抗凋亡蛋白，其可改善新生大鼠的神經(jīng)功能，在體外研究中同樣具有神經(jīng)保護功能［10－11］。本研究結(jié)果顯示，ISO的預處理可增加Bcl-2的表達水平，ISO組與單純MCAO組差異具有顯著性，同樣在24 h到達峰值。ISO的預處理增加Bcl-2表達，通過減緩細胞凋亡進程達到神經(jīng)保護的作用。

由于認識不足，濕地往往被人們作為荒地、荒水、荒草看待，不重視濕地生態(tài)保護和生態(tài)旅游開發(fā)。政府需要加強濕地生態(tài)教育，通過各種形式，增強人們濕地旅游意識，使人們養(yǎng)成愛濕地、護濕地、用濕地的好風氣。

綜上所述，經(jīng)異氟烷預處理后，大鼠神經(jīng)功能評分顯著降低，損傷程度更小，腦梗死面積明顯縮小；腦組織HIF-1α、HO-1以及Bcl-2表達水平顯著上調(diào)，24 h達到最高值。可見，異氟烷預處理能降低MCAO大鼠缺血再灌注損傷，具有腦保護功能。

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Cerebral protective effect of isoflurance preconditioning for adult ratmodel w ith local cerebral ischem ia

Qiu Yan1，Dong Bin2，Cai Xiaolan1
（1Dept of Anesthesiology，2Dept of Neurosurgery，The First Affiliated Hospital to Dalian Medical University，Dalian 116011）

Objective To investigate the brain protective effects of isoflurane preconditioning for local cerebral ischemia adult ratmodel by detecting HIF-1α，HO-1 and Bcl-2 expression level.Methods84 two-month old Sprague-Dawley male rats were randomly divided into sham group，ischemia-reperfusion group（MCAO group）and isoflurance preconditioning group（ISO group）.ISO group was exposed to isoflurane for 30 min and then underwent a 90 min middle cerebral arterial occlusion（MCAO），while MCAO group underwent MCAO only.At 24 h after reperfusion all the groups were investigated by modified neurological severity score for neurological deficits，TTC staining for infarct percentage.Cerebral cortices were harvested for HIF-1α，HO-1 and Bcl-2 protein expression level detection at 6 h，24 h and 72 h after reperfusion using RT-PCR and western blot.ResultsThemNSS score and infarct percentage in ISO group decreased significantly compared with those ofMCAO group at24 h after reperfusion（P＜0.05）.Compared with the MCAO group，ISO group had significantly up-regulated protein levels of HIF-1α，HO-1 and Bcl-2 at6 h and 24 h after reperfusion（P＜0.05）.There was no difference between ISO group and MCAO group for 3 gene expression at 72 h（P＞0.05）.ConclusionIsoflurane preconditioning plays shortterm cerebral protective effect through the up regulation of HIF-1α，HO-1 and Bcl-2 gene expression.

isoflurane；preconditioning；cerebral protection；Bcl-2；HIF-1α；HO-1

R 971.2

A

1000－1492（2015）08－1099－04

2015－03－24接收

國家自然科學基金（編號：81371454）

大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院1麻醉科、2神經(jīng)外科，大連116011

邱 焱，女，碩士研究生；

蔡曉嵐，女，主治醫(yī)師，責任作者，E-mail：xiaolancai＠126. com