Apobec-1重組腺病毒治療腎性高脂血癥的實(shí)驗(yàn)研究

孔海波，胡 波，胡鵬

Apobec-1重組腺病毒治療腎性高脂血癥的實(shí)驗(yàn)研究

孔海波，胡 波，胡鵬

目的探討肝臟獲得性表達(dá)載脂蛋白B編輯催化多肽-1（Apobec-1）對腎性血脂代謝紊亂的調(diào)控效應(yīng)。方法30只健康普通級雄性新西蘭兔隨機(jī)分為假手術(shù)組、腎病組、Apobec-1治療組，每組10只。腎病組、Apobec-1治療組適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后行左腎切除術(shù)，術(shù)后1周耳緣靜脈注射阿霉素（4 mg／kg）構(gòu)建腎病模型。術(shù)后11周Apobec-1治療組耳緣靜脈注射Apobec-1重組腺病毒（1×1013病毒顆粒／kg）。術(shù)后12周處死所有兔，并摘除右側(cè)腎臟和肝臟，分別留取血液及24 h尿液，檢測24 h尿蛋白（24UPr）、白蛋白（Alb）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、血脂等指標(biāo)，HE染色觀察腎臟病理，Western blot檢測肝臟Apobec-1、載脂蛋白B48（ApoB48）蛋白表達(dá)水平。結(jié)果①與假手術(shù)組比較，腎病組24UPr、BUN、Cr、總膽固醇（TC）、總?cè)８视停═G）、極低密度脂蛋白（VLDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）、載脂蛋白B100（ApoB100）明顯升高（P＜0.05），而Alb水平明顯下降（P＜0.05）；②與腎病組比較，Apobec-1治療組TC、TG、VLDL-C、LDL-C、ApoB100、ApoB48水平明顯下降（P＜0.05）；③與假手術(shù)組比較，Apobec-1治療組24UPr、BUN、Cr明顯升高（P＜0.05），而Alb、ApoB48明顯下降（P＜0.05）；④Western blot結(jié)果顯示，與假手術(shù)組、腎病組比較，Apobec-1治療組肝臟Apobec-1、ApoB48表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01）。結(jié)論腎性高脂血癥中，肝臟獲得性表達(dá)Apobec-1，重建ApoB mRNA編輯，增加ApoB48-脂蛋白的合成，進(jìn)而起到一定的降脂效應(yīng)。

高脂血癥；載脂蛋白B編輯催化多肽-1；載脂蛋白B100；載脂蛋白B48

腎性高脂血癥不僅是心血管疾病發(fā)生的主要高危因素，且參與腎病進(jìn)展［1］。目前，傳統(tǒng)降脂藥物在30%的患者中會出現(xiàn)各種不同程度藥物不良反應(yīng)［2］。所以對于這部分患者，治療則需另辟蹊徑。載脂蛋白B編輯催化多肽-1（apolipoprotein B editing catalytic polypeptide-1，Apobec-1）是調(diào)控載脂蛋白B（apolipoprotein B，ApoB）mRNA編輯的特異性酶復(fù)合物中的催化亞基［3］。大量動物實(shí)驗(yàn)研究［4-7］證實(shí)：通過構(gòu)建Apobec-1重組腺病毒轉(zhuǎn)染鼠或兔，使肝臟獲得性表達(dá)Apobec-1，重建ApoB mRNA，具有一定的降脂效應(yīng)。然而，腎性高脂血癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，上述方法是否有一定降脂效應(yīng)，仍需進(jìn)一步探究。該研究采用單側(cè)腎切除單次注射阿霉素制作腎病模型，轉(zhuǎn)染Apobec-1重組腺病毒，觀察其對腎病兔血脂代謝及肝臟Apobec-1、載脂蛋白B 48（ApoB48）表達(dá)的影響，明確其對腎性血脂代謝紊亂的調(diào)控效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 動物模型建立及標(biāo)本制備6月齡健康雄性普通級新西蘭兔30只，體重1 000～2 000 g，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物來源于南京安立默科技有限公司。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將新西蘭兔隨機(jī)分為假手術(shù)組、腎病組、Apobec-1治療組，每組10只。置于代謝籠中飼養(yǎng)。腎病組和Apobec-1治療組以3%的戊巴比妥30 mg／kg行腹腔注射麻醉，無菌條件下行左腎切除，假手術(shù)組只探及腎包膜，并不切除左腎。1周后，腎病組和Apobec-1治療組耳緣靜脈注射阿霉素4 mg／kg，假手術(shù)組靜脈注射等量生理鹽水。術(shù)后11周，Apobec-1治療組耳緣靜脈注射Apobec-1重組腺病毒。術(shù)后12周，禁食12 h后第2天抽取血標(biāo)本及留取24 h尿液，隨后全部處死，血液、尿液及時(shí)送檢；摘除腎臟，濾紙吸干后于10%中性福爾馬林溶液固定，待做腎臟病理檢查；摘除肝臟，濾紙吸干后稱重，剪取部分組織置EP管中，于－80℃低溫冰箱保存，待做Western blot檢測。

1.2 主要儀器及試劑UV-1200分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；TS-A型脫色搖床（上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司）；DYY-TC型電泳儀（北京市六一儀器廠）；SZ-1型快速混勻器（江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所）；Tanon-5500發(fā)光成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；D-78532 Tuttlingen離心機(jī)（廣東省醫(yī)療器械廠）；Apobec-1重組腺病毒（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）；阿霉素（北京雅安達(dá)生物公司）；兔源抗Apobec-1多克隆抗體（北京奧維亞生物技術(shù)有限公司）；山羊抗ApoB48多克隆抗體（美國Abcam公司）；ECL-發(fā)光液（美國Thermo scientific公司）；常規(guī)試劑均為國產(chǎn)。

1.3 構(gòu)建Apobec-1重組腺病毒①TRIzol法提取SD大鼠腸道總RNA；②RT-PCR擴(kuò)增Apobec-1全長cDNA；③將rApobec-1基因裝載至pUC57-Simple載體上；④pYr-ads-4-rApobec-1構(gòu)建；⑤通過LR體外同源重組將rApobec-1表達(dá)框構(gòu)建至pAd／PL-DEST腺病毒表達(dá)載體上；⑥包裝重組腺病毒。

1.4 血尿指標(biāo)及腎臟病理檢測方法雙縮脲比色法檢測24 h尿蛋白濃度（24 hour urinary protein，24UPr）；酶法測定白蛋白（albumin，Alb）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、肌酐（creatinine，Cr）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、總?cè)８视停╰otal triglyceride，TG）和高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL-C）濃度；Friedewald公式估算血漿極低密度載脂蛋白（very low density lipoprotein，VLDL-C）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL-C）濃度；放射免疫法測定血漿載脂蛋白B100（ApoB100）和ApoB48濃度；HE染色觀察腎臟病理改變。

1.5 Westernblot檢測肝臟Apobec-1和ApoB48表達(dá)水平常規(guī)方法提取肝臟總蛋白，測定其蛋白濃度，將蛋白濃度稀釋至同一濃度；制備SDS-PAGE凝膠；電泳；轉(zhuǎn)膜；5%脫脂牛奶封閉過夜；加入一抗（兔源抗Apobec-1多克隆抗體1∶500；羊源抗ApoB48多克隆抗體1∶1 000；鼠源抗β-actin單克隆抗體1∶2 000），室溫孵育2 h，0.05%PBST洗3次，每次10 min，PBS洗1次，每次10 min；加入二抗（HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗1∶50 000；HRP標(biāo)記的兔抗羊二抗1∶50 000；HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗1∶ 100 000），室溫孵育3 h，0.05%PBST洗3次，每次10 min，PBS洗1次，每次10 min；在發(fā)光成像系統(tǒng)中進(jìn)行ECL顯色、曝光、拍攝；對條帶進(jìn)行相對光密度分析，通過與內(nèi)參β-actin的條帶光度值的比值間接反映Apobec-1及ApoB48的表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)以±s表示，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 血尿生化指標(biāo)比較3組之間血尿指標(biāo)比較顯示24UPr、Alb、BUN、Cr、TC、TG、VLDL-C、LDL-C、ApoB100、ApoB48差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。與假手術(shù)組相比，腎病組24UPr、BUN、Cr、TC、TG、VLDL-C、LDL-C、ApoB100明顯升高（P＜0.05），Alb明顯下降（P＜0.05），而HDL-C、ApoB48未見明顯變化；與腎病組相比，Apobec-1治療組TC、TG、VLDL-C、LDL-C、ApoB100、ApoB48明顯下降（P＜0.05），而24UPr、Alb、BUN、Cr、HDL-C未見明顯變化；與假手術(shù)組比較，Apobec-1治療組24UPr、BUN、Cr增高（P＜0.05），Alb、ApoB48下降（P＜0.05），而TC、TG、VLDL-C、LDL-C、HDL-C、ApoB100未見明顯變化，見表1。

2.2 腎臟病理學(xué)改變假手術(shù)組腎臟病理顯示腎組織結(jié)構(gòu)無明顯異常；腎病組和Apobec-1治療組腎臟病理顯示腎臟組織細(xì)胞增生肥大、排列紊亂，腎小球囊壁增厚，局部可見粘連，腎間質(zhì)增寬，充滿基質(zhì)，可見大量炎性細(xì)胞浸潤，部分可見腎小球局灶性壞死，見圖1。

2.3 肝臟Apobec-1、ApoB48蛋白表達(dá)變化

Westernblot結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，腎病組Apobec-1、ApoB48蛋白表達(dá)未見明顯變化；與腎病組、假手術(shù)組比較，Apobec-1治療組Apobec-1、ApoB48蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01），見圖2。

表1 各組血尿生化指標(biāo)比較（n＝10，±s）

表1 各組血尿生化指標(biāo)比較（n＝10，±s）

與假手術(shù)組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與腎病組比較：＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

指標(biāo)假手術(shù)組腎病組Apobec-1治療組F值P值24UPr（g／L）0.28±0.13 1.40±0.35**1.38±0.38**42.778 0.000 Alb（g／L）54.43±6.00 48.52±5.78*47.59±6.15*3.819 0.034 BUN（mmol／L）7.91±1.35 9.64±1.21**10.27±1.94**6.562 0.005 Cr（μmol／L）82.70±10.44 127.00±22.07**123.25±24.14**16.076 0.000 TC（mmol／L）0.88±0.10 1.28±0.25**0.93±0.09＃＃17.531 0.000 TG（mmol／L）0.66±0.14 1.03±0.38**0.72±0.14＃6.192 0.006 VLDL-C（mmol／L）0.30±0.07 0.47±0.17**0.33±0.06＃6.192 0.006 LDL-C（mmol／L）0.10±0.03 0.31±0.10**0.09±0.02＃＃34.924 0.000 HDL-C（mmol／L）0.48±0.11 0.50±0.06 0.51±0.04 0.511 0.605 ApoB48（mg／L）23.14±0.63 23.35±1.29 21.75±1.04*＃＃6.161 0.006 ApoB100（mg／L）25.46±1.11 27.36±2.03*25.15±1.90＃＃5.180 0.012

3 討論

高脂血癥是腎病綜合征的典型表現(xiàn)，包括高TC血癥，高TG血癥，常伴有LDL-C、VLDL-C、中間密度脂蛋白及脂蛋白a的升高，以及HDL-C降低或不變［8］。其中，高TC血癥是腎病最常見的高血脂類型［9］。高TC血癥主要以LDL-C升高為主，其機(jī)制［9］主要表現(xiàn)為：①HMG-CoA還原酶升高；②膽固醇7α羥化酶下降；③低密度脂蛋白受體缺陷；④酯酰輔酶A膽固醇脂酰轉(zhuǎn)移酶2代償升高。可見，腎性高脂血癥發(fā)生機(jī)制極其復(fù)雜。目前腎病綜合征模型的建立，主要采用單側(cè)腎切除后單次注射阿霉素構(gòu)建，一般3個(gè)月左右可出現(xiàn)腎病綜合征典型表現(xiàn)［10］。且該方法具有死亡率低、成模率高、重復(fù)性好及方法簡短等優(yōu)點(diǎn)。本研究通過上述方法建立腎病模型，結(jié)果顯示腎病組血尿生化指標(biāo)和腎臟病理與臨床人類腎病綜合征臨床和病理特征相類似［11］，且血脂類型符合高TG血癥，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)提供一定的模型基礎(chǔ)。

ApoBmRNA編輯是調(diào)控血漿脂蛋白代謝的重要遺傳機(jī)制［12］。其編輯過程主要受特異性酶復(fù)合物調(diào)控。維持特異性酶復(fù)合物活性至少需要兩種亞單位同時(shí)存在，即催化亞基（ApoB編輯催化多肽-1）和結(jié)合亞基（Apobec-1輔助因子）。在人類和兔中，ApoBmRNA雖可在腸道發(fā)生廣泛編輯而合成ApoB48，但在肝臟卻不被編輯而僅分泌全基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物ApoB100［13］。人類和兔Apobec-1基因缺少肝臟特異性啟動子序列是導(dǎo)致上述器官差異性表達(dá)Apobec-1的主要原因［13］。然而，在其它一些哺乳動物（如：狗、馬和鼠類），ApoBmRNA在肝臟和腸道均可被編輯而合成分泌ApoB48-脂蛋白，同時(shí)伴隨低血漿ApoB100-脂蛋白［14］。現(xiàn)有的研究顯示，通過轉(zhuǎn)染Apobec-1重組腺病毒，可在肝臟短期表達(dá)Apobec-1，這種方式的降脂作用已在多種動物模型中得到體現(xiàn)［4-7］。本研究選用腎病兔為動物模型，轉(zhuǎn)染Apobec-1重組腺病毒1周后發(fā)現(xiàn)，Apobec-1治療組的血脂水平明顯低于腎病組，且與假手術(shù)組血脂水平基本持平。可見，腎性高脂血癥中，通過轉(zhuǎn)染Apobec-1重組腺病毒可起到一定降脂效應(yīng)。本研究通過Westernblot法檢測肝臟Apobec-1、ApoB48的表達(dá)，結(jié)果顯示Apobec-1治療組肝臟Apobec-1、ApoB48表達(dá)明顯高于腎病組及假手術(shù)組。可見，通過轉(zhuǎn)染Apobec-1重組腺病毒，可使腎病兔肝臟獲得性表達(dá)Apobec-1，促進(jìn)肝臟ApoBmRNA重建，增加ApoB48-脂蛋白的合成。然而，本研究觀察各組血清ApoB100、ApoB48變化顯示，與腎病組比較，Apobec-1治療組血清ApoB100、ApoB48均有所下降。既往有研究［15］顯示ApoB20、ApoB40可以形成pre-VLDL，但是形成的pre-VLDL在囊泡運(yùn)輸過程中受到阻礙，以至于VLDL組裝的效率極低，但當(dāng)截?cái)辔镞_(dá)到ApoB48，VLDL組裝的效率大大提高。故此，本研究提出Apobec-1治療組血清ApoB48下降可能為其代謝速率迅速所致，但其代謝機(jī)制尚需進(jìn)一步探究。

綜上所述，腎性高脂血癥中，通過轉(zhuǎn)染重組腺病毒，可使肝臟獲得性表達(dá)Apobec-1，促進(jìn)肝臟ApoB mRNA編輯，增加ApoB48-脂蛋白的合成，具有一定降脂效應(yīng)。

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Experimental study of Apobec-1 recombinant adenovirus in treatment of renal hyperlipem ia

Kong Haibo，Hu Bo，Hu Peng
（Dept of Pediatric，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

Objective To explore the effect of the liver acquired expression of apolipoprotein B editing catalytic polypeptide-1（Apobec-1）on hyperlipidemia of renal disease.MethodsThirty healthy ordinary levelmale New Zealand rabbits were randomly divided into three groups：sham operation group，nephropathy group，and Apobec-1 treatment group（Each group has10 rabbits）.Adapt feeding for one week，nephropathy group and Apobec-1 treatment group underwent left nephrectomy，and one week later，adriamycin（4mg／kg）was used to construct the nephropathymodel by ear vein injection.The eleventh week after operation，apobec-1 recombinant adenovirus（1× 1013Virus／kg）was injected by ear vein in apobec-1 treatment group.The twelfth week after operation，all rabbits were sacrificed.Right kidney，liver，blood and 24h urine were left.In three groups，24 hour urinary protein（24UPr），albumin（Alb），blood urea nitrogen（BUN），creatinine（Cr），blood lipid were detected.Renal pathology was observed by HE staining.Expressions of liver apobec-1，apolipoprotein B48（ApoB48）were observedby Western blot.Results①Compared with the sham operation group，nephropathy group showed that 24UPr，BUN，Cr，total cholesterol（TC），total triglyceride（TG），very low density lipoprotein（VLDL-C），low density lipoprotein（LDL-C），apolipoprotein B100（ApoB100）were increased（P＜0.05），but Alb was decreased（P＜0.05）.②Compared with the nephropathy group，Apobec-1 treatmentgroup showed that TC，TG，VLDL-C，LDLC，ApoB100，ApoB48 were decreased（P＜0.05）.③Compared with the sham operation group，Apobec-1 treatment group showed that 24UPr，BUN，Cr were increased（P＜0.05），but Alb，ApoB48 were decreased（P＜0.05）.④Compared with the sham operation group and nephropathy group，Apobec-1 treatmentgroup showed that the expression of Apobec-1 and ApoB48 were up-regulated（P＜0.01）.ConclusionWhen liver aquires expression of Apobec-1 in hyperlipidemia of renal disease，it can reconstruct ApoB mRNA，increase the synthesis of ApoB48-lipoprotein，and play a certain lipid-lowering effect.

hyperlipidemia；apolipoprotein B editing catalytic polypeptide-1；apolipoprotein B100；apolipoprotein B48

R 726.92

A

1000－1492（2015）08－1049－05

2015－04－29接收

安徽省自然科學(xué)基金（編號：1208085MH153）

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，合肥 230022

孔海波，男，碩士研究生；

胡 波，男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：hubo3218＠sohu.com