Propachlor對前列腺癌細胞PC3及LNCaP的作用及其可能機制

邰 勝，徐凌凡，徐 明，張陽陽，張 力，梁朝朝

◇基礎(chǔ)醫(yī)學研究◇

Propachlor對前列腺癌細胞PC3及LNCaP的作用及其可能機制

邰 勝1，2，徐凌凡1，徐 明1，張陽陽1，張 力1，2，梁朝朝1，2

目的探討化合物Propachlor對前列腺癌的作用及可能的分子機制。方法用梯度濃度的化合物Propachlor處理前列腺癌PC3及LNCaP細胞株；使用CellTiter方法檢測腫瘤細胞的存活率，Western blot法檢測細胞自噬蛋白LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)變情況，熒光顯微鏡檢測細胞中誘導LC3質(zhì)粒標記綠色熒光蛋白（GFP-LC3）的表達情況。結(jié)果Propachlor可以抑制前列腺癌PC3及LNCaP細胞的存活率，同時劑量越大腫瘤細胞存活率抑制越明顯；Propachlor可以誘導PC3及LNCaP腫瘤細胞自噬蛋白LC3-Ⅱ及自噬小體GFP-LC3的表達，誘導自噬效應(yīng)同Propachlor的劑量正相關(guān)。結(jié)論化合物Propachlor具有抗前列腺癌的生物學效應(yīng)，同時該抗腫瘤效應(yīng)是通過激活細胞內(nèi)自噬效應(yīng)產(chǎn)生的。

前列腺癌；Propachlor；自噬

前列腺癌是老年男性一種常見的泌尿外科疾病，近年來在我國前列腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢。同時有相當一部分前列腺癌發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)為晚期，對現(xiàn)有的外科及內(nèi)分泌治療效果均不佳；因此，研究開發(fā)出新的晚期前列腺癌治療方法十分必要［1］。通過高通量篩查的方法，發(fā)現(xiàn)一種新的化合物Propachlor，具有抗前列腺癌的生物學效應(yīng)，分子式見圖1。自噬是細胞體內(nèi)一種自身蛋白質(zhì)的降解過程，相關(guān)的研究［2］表明誘導腫瘤細胞體內(nèi)的自噬效應(yīng)具有抗腫瘤的生物學效應(yīng)。該研究使用化合物Propachlor處理前列腺癌PC3及LNCaP細胞，觀察化合物Propachlor是否通過激活細胞內(nèi)自噬效應(yīng)起到抗前列腺癌的生物學效應(yīng)，為前列腺癌的治療提供新的思路與策略。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料前列腺癌LNCaP細胞購自美國ATCC公司；前列腺癌PC3細胞由美國加州大學洛杉磯分校Jiaoti Huang教授提供［3］；化合物Propachlor購自美國Sigma公司；CellTiter購自美國Promega公司；LC3質(zhì)粒標記綠色熒光蛋白（green-fluorescent-LC3，GFP-LC3）轉(zhuǎn)染質(zhì)粒、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；兔抗LC3多克隆抗體購自美國GenScript公司；鼠抗β-actin抗體、ECL試劑盒及細胞培養(yǎng)試劑均購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞存活率及生長曲線 前列腺癌PC3及LNCaP細胞分別在含有5%胎牛血清的DMEM及RPMI培養(yǎng)基，37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，后使用梯度濃度劑量的化合物Propachlor（0、2.5、5、10μmol／L）處理LNCaP及PC3細胞株24 h，使用CellTiter試劑盒裂解細胞測定細胞ATP，檢測細胞的相對存活率。后再次使用梯度濃度劑量的化合物Propachlor（0、2.5、5、10μmol／L）處理LNCaP及PC3細胞株1、2、3、4 d，使用CellTiter的方法測定腫瘤細胞的生長曲線。

1.2.2 Western blot檢測化合物Propachlor處理后腫瘤細胞LC3表達 分別使用梯度濃度劑量的化合物Propachlor（0、2.5、5、10μmol／L）處理培養(yǎng)后的LNCaP及PC3細胞株24 h，使用細胞裂解液（20 mol／L KCl，150 mol／L NaCl，1%NP-40，50 mol／L NaF，50 mol／L TrisHCl，pH＝7.5，1 mol／L DTT，1 mol／L EGTA，1×Protease Inhibitor，10%Glycerol）在冰上裂解細胞5 min，4℃、1 500 r／min離心15min，使用Bradford Assay試劑盒對裂解液上清液中蛋白質(zhì)濃度進行相關(guān)測定。等量蛋白的裂解液上樣在15%SDS-PAGE凝膠，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；使用脫脂牛奶對PVDF膜封閉1 h，LC3一抗將封閉的PVDF膜進行孵育過夜，PBS洗滌30 min，二抗孵育30 min，PBS洗滌約30 min，采用ECL試劑盒檢測LC3蛋白質(zhì)的表達。

1.2.3 免疫熒光檢測細胞中自噬小體的表達 腫瘤細胞使用Lipofectamine 2000質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染，24 h后更換培養(yǎng)基。分別使用梯度濃度劑量的化合物Propachlor（0、2.5、5、10μmol／L）處理轉(zhuǎn)染后的LNCaP及PC3細胞株24 h。使用4%多聚甲醛固定細胞約30 min，用PBS洗滌細胞2次，再用DAPI染色15min，熒光顯微鏡下觀察自噬小體的表達情況。

1.3 統(tǒng)計學處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，組間比較采用獨立樣本t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 化合物Propachlor抑制前列腺癌細胞生長

使用梯度濃度劑量的化合物Propachlor（0、2.5、5、10 μmol／L）處理培養(yǎng)后的前列腺癌LNCaP及PC3細胞株24 h，發(fā)現(xiàn)隨著Propachlor濃度的增大腫瘤癌細胞的存活率被抑制的越多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；使用梯度濃度劑量化合物處理前列腺癌PC3及LNCaP細胞1、2、3、4 d后，腫瘤細胞的生長曲線進一步表明化合物Propachlor可以明顯抑制腫瘤細胞的生長，且隨著Propachlor劑量的增加，腫瘤細胞的生長抑制越顯著，見圖2。

2.2 化合物Propachlor可以誘導腫瘤細胞自噬蛋白LC3的表達隨著濃度的增加腫瘤細胞中LC3-Ⅰ型分子向LC3-Ⅱ型分子轉(zhuǎn)變的趨勢越明顯，表明化合物Propachlor可以誘導前列腺腫瘤細胞PC3、LNCaP的自噬效應(yīng)，同時隨著Propachlor劑量的增加誘導自噬的效應(yīng)越明顯，見圖3。

2.3 化合物Propachlor可以誘導腫瘤細胞自噬小體GFP-LC3 dots的表達是自噬小體的一種結(jié)構(gòu)，在熒光顯微鏡下一般分布在細胞膜周圍呈戒指環(huán)樣結(jié)構(gòu)，也可呈多聚點狀分布。當前列腺癌細胞PC3及LNCaP接受化合物Propachlor處理后可以誘導GFP-LC3的表達；同時隨著Propachlor濃度的增加，誘導表達的GFP-LC3分子越多，表明高劑量的化合物濃度可以誘導較強的自噬效應(yīng)，見圖4。

3 討論

前列腺癌是歐美男性一種常見的惡性腫瘤，近年來發(fā)病率在我國呈上升趨勢［1］。其中有一部分前列腺癌患者發(fā)現(xiàn)時已為晚期前列腺癌，已經(jīng)失去手術(shù)時機；同時絕大多數(shù)前列腺癌患者對目前的內(nèi)分泌治療及新型分子藥物的治療均會出現(xiàn)不同程度的耐受，最終會轉(zhuǎn)變?yōu)榧に氐挚剐郧傲邢侔╟astra-tion resistant prostate cancer，CRPC）［2，4－7］。因此，十分有必要發(fā)現(xiàn)新型的化合物去治療前列腺癌，尤其是晚期前列腺癌CRPC。

通過高通量篩查的實驗方法發(fā)現(xiàn)一種新的化合物Propachlor具有較強的抗前列腺癌的生物學效應(yīng)，可以明顯抑制前列腺癌細胞PC3、LNCaP的存活率；對腫瘤細胞的生長曲線也可以明顯抑制。進一步研究表明Propachlor對前列腺癌細胞生長的抑制是通過誘導了腫瘤細胞體內(nèi)的自噬效應(yīng)完成的。自噬發(fā)生過程主要是吞噬需要降解的細胞器、蛋白質(zhì)等形成自噬體，并與內(nèi)涵體形成所謂的自噬內(nèi)涵體，最后與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物，以實現(xiàn)細胞穩(wěn)態(tài)和細胞器的更新［6－7］。同時細胞體內(nèi)的自噬效應(yīng)同細胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶－蛋白激酶A-雷帕霉素（PI3K-AKt-mTOR）下游等多條信號轉(zhuǎn)導通路的調(diào)節(jié)有著密切的相關(guān)性；有研究表明誘導自噬可以起到抗腫瘤的作用，亦有相關(guān)的研究表明抑制自噬也可以起到抑制腫瘤的生物學效應(yīng)；認為自噬是在腫瘤細胞生長的調(diào)控中起到雙刃劍的作用［8－14］。目前，已有研究［6］表明多種化合物均具有不同程度誘導、抑制細胞自噬的作用。蛋白LC3為自噬小體形成過程中一種重要的蛋白分子，其生物學形式具有LC3-Ⅰ及LC3-Ⅱ兩種形式，LC3-Ⅱ型蛋白具有較強的生物學活性；目前普遍認為在自噬的形成過程中普遍存在著LC3-Ⅰ型分子向LC3-Ⅱ型分子的轉(zhuǎn)變，因此LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ分子之間的比例與細胞體內(nèi)自噬誘導的程度呈正相關(guān)性。

使用梯度濃度劑量的化合物Propachlor（0、2.5、5、10μmol／L）處理培養(yǎng)后的前列腺癌LNCaP及PC3細胞株24 h，在PC3及LNCaP細胞中均發(fā)現(xiàn)LC3-Ⅰ型蛋白向LC3-Ⅱ型蛋白的轉(zhuǎn)變，同時隨著化合物劑量的增加，LC3-Ⅰ型向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)變的趨勢越明顯，表明化合物Propachlor可以誘導自噬效應(yīng)，自噬的誘導同化合物的濃度劑量呈正相關(guān)性。化合物均存在著相關(guān)的細胞毒性效應(yīng)并且細胞毒性效應(yīng)與其劑量呈正相關(guān)性，因此對化合物Propachlor誘導腫瘤細胞自噬的生物學效應(yīng)仍應(yīng)進一步評價其對細胞的細胞毒性效應(yīng)。當細胞體內(nèi)誘導自噬后自噬體形成最終會和溶酶體相結(jié)合形成自噬溶酶體，自噬溶酶體可聚集形成點狀結(jié)構(gòu)；帶有GFP標記的LC3蛋白分子在熒光顯微鏡下即可表現(xiàn)出點狀結(jié)構(gòu)［8］，進一步從形態(tài)學角度證明化合物Propachlor可以誘導前列腺癌PC3及LNCaP細胞的自噬效應(yīng)，同時誘導的自噬效應(yīng)同化合物的濃度呈正相關(guān)性。前列腺癌為前列腺惡性腫瘤中最為常見的一種病理學類型，LNCaP細胞為一種腺癌細胞可以代表臨床上絕大多數(shù)前列腺惡性腫瘤的生物學性狀；因此可以進一步使用腫瘤患者的前列腺癌細胞株去檢測化合物Propachlor抗前列腺癌生物學效應(yīng)及誘導自噬情況；臨床上有相當一部分前列腺癌為CRPC及對晚期的內(nèi)分泌治療均不佳，有相關(guān)研究［3］表明前列腺癌PC3細胞具備前列腺小細胞癌的生物學特性，因此化合物Propachlor對前列腺小細胞癌也可存在通過誘導自噬抗腫瘤生長的生物學效應(yīng)。可以進一步建立前列腺癌小鼠動物模型，在前列腺癌患者的細胞中檢測化合物Propachlor抗腫瘤及誘導自噬的生物學效應(yīng)，為前列腺癌的治療提供新的策略與新思路。

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The function and possiblemechanism of Propachlor on anti-prostate cancer LNCaP and PC3 cells

Tai Sheng1，2，Xu Lingfan1，Xu Ming1，et al
（1Dept of Urology，The First Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230022；2The Urological Institute of AnhuiMedical University，Hefei 230032）

Objective To explore themechanism of Propachlor anti-prostate cancer.MethodsThe LNCaP and PC3 cellswere treated with Propachlorwith the gradient concentration.The CellTiterwas performed to test the cell variability，and the western blotwas also performed to detect the LC3-Ⅱconversion.The GFP-LC3 was observed under the fluorescencemicroscope.ResultsThe PC3 and LNCaP cells variability was inhibited with the Propachlor，and little cell variability was linked with high concentration Propachlor.The Propachlor might induce the PC3 and LNCaP cells autophagy with LC3-Ⅱconversion and GFP-LC3 dots increase，which was also linked with high concentration Propachlor.ConclusionThe compound Propachlormay be anti-prostate cancer via induction of autophagy among prostate cancer cells.

prostate cancer；Propachlor；autophagy

R 737.25

A

1000－1492（2015）08－1045－04

2015－04－22接收

安徽省自然科學基金（編號：1308085QH132）；國家自然科學基金青年科學基金培養(yǎng)計劃（編號：2012KJ13）；國家臨床重點專科建設(shè)項目基金（編號：2100299）；院內(nèi)博士科研基金（編號：20120119）

1安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科，合肥 230022

2安徽醫(yī)科大學泌尿外科研究所，合肥 230032

邰 勝，男，醫(yī)師，博士；

梁朝朝，男，主任醫(yī)師，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：Liang＿chaozhao＠163.com