一種可用于條件性位置偏愛實驗的疼痛大鼠模型

葉少劍，黃念芳，陳曉青，湯凌燕，李長雷

（江漢大學 醫學院 a.藥理學教研室； b.實驗動物中心，湖北 武漢 430056）

疼痛是一種與組織損傷相關聯的不愉快的感覺和情感體驗。清醒個體對疼痛的感受具有主觀和客觀兩個方面。對于同一強度的致痛刺激，不同個體的主觀痛感及情感體驗有強弱之分；客觀上感受疼痛的痛覺閾值存在個體差異。情緒等主觀感覺還會對痛覺閾值產生一定影響［1-2］。所以如何準確測定疼痛程度至今是個難題。對鎮痛藥物鎮痛效應的檢測，目前的動物模型和檢測方法是以疼痛閾值測定為主，即用藥后如果動物對某一刺激的疼痛閾值提高，則反映藥物對某刺激造成的疼痛具有鎮痛效應。這是檢測鎮痛藥抑制疼痛的客觀方面的反映。在客觀檢測到藥物具有提高疼痛閾值作用后，由于動物無法告訴實驗者其用鎮痛藥后的感覺，如何使用適合觀察疼痛動物情緒反應的動物模型及指標，了解實驗動物接受鎮痛藥物后的主觀感受是一個值得探討的問題。

條件性位置偏愛（conditioned place prefer?ence，CPP）實驗是神經科學研究中常用的清醒動物行為學實驗方法。經過伴藥適應訓練后動物對試驗箱的選擇性偏愛可以間接反映動物用藥后的主觀感受。該實驗需要連續數天進行，因此如果用于觀察鎮痛藥物的作用需要能在一定時期內產生持續性疼痛的動物模型，通常用于痛閾測試的動物模型并不適合。手術后切口痛是臨床最常見的疼痛類型，并且通常持續數天。已經建立的模仿切口痛的大鼠模型其切口在腳掌部位［3］或附近［4］，會影響動物行動，不利于CPP實驗。為了不影響手術后動物自由行走以及隨后的抓持給藥，本研究嘗試改變切口部位，以便于進行CPP實驗觀察動物對鎮痛藥物的主觀反應。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠30只，購入時體重200～250 g，購自華中科技大學同濟醫學院醫學實驗動物中心（SPF級，合格證號4209800346）。適應性飼養3 d后開始實驗，每籠飼養2只，大鼠自由進食和飲水。本實驗獲得江漢大學醫學倫理委員會批準。

1.2 實驗藥物

戊巴比妥鈉原料藥，Sigma公司產品，使用前用蒸餾水配制成3%（W/V）溶液；酚咖片（每片含對乙酰氨基酚500 mg及咖啡因65 mg）為中美天津史克制藥有限公司市售產品，批號：11010495，使用前以蒸餾水配成20 mg/mL混懸液備用。

1.3 實驗裝置及使用

偏性（biased）CPP實驗裝置及軟件分析系統（上海移數信息科技有限公司產品）由黑箱和白箱組成，各箱頂蓋中間均鑲嵌攝像鏡頭，與數據采集系統連接。黑白兩箱中間隔以較小的灰箱供檢測時放入動物。灰箱兩側各有一門分別與黑箱、白箱相通，門可以通過插入隔板關閉。白箱底板光滑，均勻分布著圓孔結構，頂部有白色燈光照亮箱內；黑箱底板粗糙，為條形柵欄狀結構，無光照。實驗時使用分3個階段，即天然偏愛測試（pretest）、伴藥適應及伴藥后測試（posttest）階段。CPP測試時將大鼠放入中間灰箱內，抽出兩側隔板讓三箱相通，動物可在其中自由走動。測試時間為15 min（900 s）。

1.4 建立切口疼痛大鼠模型

經過pretest后，剔除在白箱逗留時間超過400 s的大鼠共6只。將合格大鼠隨機分成手術組（model）、非手術對照組（sham）及空白對照組（blank）3組，每組8只。大鼠經腹腔注射戊巴比妥鈉溶液40 mg/kg麻醉。手術組大鼠接受造模手術，非手術組大鼠只接受麻醉不做手術。對照組大鼠腹腔注射等容量生理鹽水，不麻醉也不手術。將麻醉大鼠四肢自然伸展俯臥在手術臺上，以雙側髕骨突起處經背部連線為橫坐標，平行于脊柱右側1.0 cm處畫直線為縱坐標，以縱、橫坐標交叉處為皮膚切口下界，沿縱坐標向上1.5 cm處為切口上界。縱向切開約1.5 cm皮膚全層及皮下筋膜，然后以絲線縫合兩針關閉切口。常規給予硫酸慶大霉素腹腔注射1.6萬U預防術后感染。

1.5 伴藥適應

將CPP裝置各箱之間插入隔板將門關閉。待大鼠從麻醉中清醒并可以行走后，首先將各組大鼠置于天然偏愛箱（黑箱）內45 min，取出回籠；手術組及非手術組大鼠灌胃給予對乙酰氨基酚100 mg/kg體重，空白對照組灌胃等容量蒸餾水，15 min后均置于白箱內45 min，隨后回籠休息。每12 h重復以上過程一次，共適應4次。最后一次給藥后12～24 h內，進行posttest。

1.6 統計分析

以大鼠在白箱內停留的時間作為CPP值，比較每組大鼠在pretest和posttest中CPP值的差別，進行Student’s t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

在黑白箱偏性CPP裝置內，大鼠普遍天然偏愛黑箱，故以白箱作為伴藥箱。

手術組大鼠在手術麻醉清醒后開始伴藥適應，48 h后檢測CPP時傷口無紅腫感染，可以自由地行走穿梭于3個箱體之間，顯示下背部傷口對行走沒有造成明顯影響。

經過對乙酰氨基酚4次伴藥適應后，手術組大鼠的posttest的CPP值明顯高于pretest（P＜0.05），并高于空白對照組的postCPP（P ＜ 0.01），表明疼痛大鼠對白箱產生偏愛，對乙酰氨基酚灌胃對本組大鼠有獎賞效應；而非手術對照組和空白對照組的CPP值伴藥適應前后無明顯變化，表明對乙酰氨基酚伴藥適應并沒有使正常大鼠增加對伴藥箱的喜愛。綜合分析結果提示對乙酰氨基酚的獎賞效應與其對疼痛大鼠的鎮痛作用有關，該藥在此劑量下無明顯致依賴性潛力，見表1。

表1 切口痛對對乙酰氨基酚在大鼠條件性位置偏愛的影響（n=8，D）

表1 切口痛對對乙酰氨基酚在大鼠條件性位置偏愛的影響（n=8，D）

注：與preCPP比較，a：P＜0.05；與空白對照組比較，b：P ＜0.01。

組別手術組非手術對照組空白對照組preCPP/s 181.0±58.90165.4±84.37181.2±84.55 postCPP/s 278.1±78.75a，b 221.7±85.75154.6±79.68

3 討論

鎮痛藥物具有“獎賞效應”，即個體用藥后主觀感覺變好，在此影響下個體會希望再次用藥。產生獎賞效應有兩個可能原因：一是疼痛伴隨的不愉快感覺會隨著疼痛的減弱而消失，感覺變得好起來。這個作用只會在疼痛者身上出現；另外，部分鎮痛藥物具有致欣快作用，無論用藥者是否有疼痛存在，用藥后都會出現一種愉快的感覺，這是導致藥物濫用的主要原因。為了鑒別這兩種導致鎮痛藥物獎賞效應的因素，本文通過建立一種可以用于條件性位置偏愛（CPP）實驗的大鼠疼痛模型，一方面可以觀察疼痛大鼠用藥后的主觀感受，同時從正常對照大鼠在CPP實驗中的表現可以判斷該藥物是否具有致依賴性潛力。

酚咖片主要成分為對乙酰氨基酚，藥理作用為解熱、鎮痛。文獻表明對乙酰氨基酚100 mg/kg的劑量在大鼠疼痛模型可以產生明顯的鎮痛作用［5］，但是對正常大鼠不會形成 CPP［6］。本實驗發現，皮膚切口位于下背部的疼痛模型大鼠在對乙酰氨基酚伴藥訓練后對伴藥側箱偏愛增加，而非手術組對照大鼠沒有產生CPP，表明該CPP的產生與藥物鎮痛作用的獎賞效應密切相關。如果這種結果發生在一個未知是否有鎮痛作用的藥物，也可以反過來推測該藥物在此劑量下具有鎮痛作用并且沒有表現出明顯的致依賴性潛力。該實驗方法還可能出現的幾種結果是：①手術組和非手術組伴藥適應后均未出現CPP；②手術組未出現CPP而未手術對照組出現CPP；③兩組均出現CPP。結果提示：①該藥物劑量未出現鎮痛作用及致依賴性潛力；②該劑量無明顯鎮痛作用（伴藥箱中對疼痛的厭惡效應抵消了欣快效應），但有致依賴性潛力；③該劑量藥物既有鎮痛作用也有致依賴性潛力。

疼痛本身伴隨著不愉快的感覺，在類似試驗中可以表現為與獎賞效應相反的厭惡效應。因而有文獻［7］提出可以用與CPP原理相似的CPA實驗評估疼痛對動物造成的不愉快性情感。大鼠背部切口痛模型也適用于這種評估。此時觀察在不用止痛藥情況下，將疼痛動物置于其天然喜愛的箱中進行適應，其對伴痛箱的厭惡程度可部分反映其疼痛程度。目前對于這種模型在此方面的應用有待進一步實驗證實。

［1］Yoshino A，Okamoto Y，Onoda K，et al.Sadness en?hances the experience of pain and affects pain-evoked cortical activities：an MEG study［J］.J Pain，2012，13（7）：628-635.

［2］楊敏，姚樹橋，張長杰.痛閾的檢測及影響因素［J］.中國康復理論與實踐，2009，15（7）：603-605.

［3］Brennan T J，Vandermeulen E P，Gebhart G F.Charac?terization of a rat model of incisional pain［J］.Pain，1996，64：493-501.

［4］范素貞，胡興國，曾因明.大鼠皮膚肌肉切口牽拉術致持續性疼痛的動物模型［J］.國際麻醉學與復蘇雜志，2010，31（2）：119-122.

［5］Im K S，Jung H J，Kim J B，et al.The antinociceptive effect of acetaminophen in a rat model of neuropathic pain［J］.Kaohsiung J Med Sci，2012，28（5）：251-258.

［6］Nazarian A，Are D，Tenayuca J M.Acetaminophen mod?ulation of hydrocodone reward in rats［J］.Pharmacol Biochem Behav，2011，99（3）：307-310.

［7］Zhang X J，Zhang T W，Hu S J，et al.Behavioral as?sessments of the aversive quality of pain in animals［J］.Neurosci Bull，2011，27（1）：61-67.