幾種中國栽培靈芝品種的RAPD 及rDNA 分子標記鑒定

黃 浩，許國權，周世力

（江漢大學 生命科學學院，湖北 武漢 430056）

靈芝（Ganodermalucidum）是一種著名的藥用真菌，對其生物學功能的研究推動了靈芝產業的發展，我國真菌登記分類還未成體系，因為菌種問題而造成了管理混亂、產品質量不穩定等問題［1］。傳統的分類鑒定主要依據子實體的形態學特征來進行，但是由于生長條件的不同導致子實體的形態學特征發生變化，一些鑒別性特征在不同種屬間的差異較小，這是傳統分類學的一個弊端［2］。近年來，在分子水平上對靈芝分類研究已經取得了不少進展，J.M.Moncalvo 等［3］通過rDNA的ITS 序列和25SrDNA D2 變異區序列對靈芝科的菌株進行了分類研究，鑒定了4 個系統發育學上的相關族（relatedclusters）。蘇春麗等［4］利用β－微管蛋白基因部分序列探討靈芝屬菌株的親緣關系。唐傳紅等［5］利用RAPD 和酯酶同工酶技術對來自國內外的10 個靈芝屬代表菌株進行了遺傳多樣性分析。其中RAPD 分析主要用于種間親緣關系的研究和分類鑒定，在靈芝屬中的研究較少［6］。ITS 序列分析在真菌屬內種間的系統發育研究中應用較為廣泛［7］。更為保守的18SrDNA則主要應用于目、科、屬等分類元階［8］。目前，中國常見的靈芝栽培品種多以商品名命名，具體分類學還不明確，品種鑒定也單方面側重于RAPD［9］或ITS 分子標記技術，每種方法都有其局限性，筆者嘗試將RAPD 與rDNA 上的ITS 序列和18SrDNA 片段分子標記技術結合起來，比較之間的結果，分析可能存在的差異，為精確探索靈芝分類提供一些借鑒。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 由江漢大學食用菌栽培實驗室提供6 個靈芝菌種，分別為甜芝、紫芝、黑芝、血芝、云芝和韓芝（見表1）。

表1 供試菌株

1.1.2 培養基 馬鈴薯固體培養基，馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂糖0.8%。

1.1.3 主要試劑和儀器 真菌基因組提取試劑盒（BioFlux）；PCR 反應試劑盒（Fermentas）；DNA 割膠回收試劑盒（BioFlux）；連接反應體系（Promega）；質粒提取試劑盒（BioFlux）；冷凍離心機（Eppendorf）；PCR 儀（Eppendorf）。

1.1.4 引物 RAPD 分析所用的10 堿基SBS 系列隨機引物購自上海賽百盛公司，ITS 和18SrDNA分析所用的引物ITS1/ITS4 和NS5/NS6 均購自上海生工公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌絲體培養和基因組提取 靈芝的菌絲體于28 ℃固體培養基培養10 d。收集菌絲，－20 ℃下保存備用。DNA 提取參照唐傳紅等［10］的方法進行，得到的DNA 溶液在1 %的瓊脂糖凝膠上電泳檢測。

1.2.2 RAPD 多態性分析 PCR 擴增儀為PTC－100 型。PCR 反應體系：10×Buffer 5μL，dNTP 4 μL，MgCl23 μL，隨機引物2 μL，模板1μL，Taq聚合酶0.5 μL，dd H2O 定容至50 μL。反應參數為：94 ℃條件模板DNA 變性5 min，94 ℃變性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，循環擴增40 次，最后在72 ℃條件下進行延伸7 min，于4 ℃結束反應。取5 μL 的擴增產物經1 %的瓊脂糖凝膠電泳（5 V/cm）30 min，EB 染色后置于凝膠成像系統照相。通過對80 個隨機引物進行RAPD分析，篩選出12 個能有效擴增且穩定性較好的隨機引物（見表2）用于進一步分析。

1.2.3 ITS－PCR 擴增 擴增體系為：10×Buffer 5 μL，dNTP 4 μL，MgCl23 μL，ITS1/ITS4 引物各1 μL，模板1μL，Taq 聚合酶0.5 μL，dd H2O 定容至50 μL。反應參數為：94 ℃條件模板DNA 變性5 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循環擴增30 次，最后在72 ℃條件下進行延伸7 min，于4 ℃結束反應。

表2 隨機引物編號及核苷酸序列（5′一3′）

1.2.4 18SrDNA 片段的擴增 擴增體系為：10×Buffer 5 μL，dNTP 4 μL，MgCl23 μL，NS5/NS6 引物各1 μL，模板1 μL，Taq 聚合酶0.5 μL，dd H2O定容至50 μL。反應參數為：94 ℃條件模板DNA變性5 min，94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循環擴增30 次，最后在72 ℃條件下進行延伸7 min，于4 ℃結束反應。

1.2.5 rDNA ITS 片段和18SrDNA 片段的序列測定 ITS 擴增產物通過DNA 凝膠回收試劑盒純化，用Promega 的pGEM－T Easy Vector連接，轉化于大腸埃希菌DH 5α菌株感受態細胞，經藍白斑篩選和PCR 鑒定后，每個樣品隨機挑選1 個陽性單克隆株測序。

1.3 數據統計與分析方法

RAPD 數據分析：定義RAPD－PCR 圖譜中不同分子量的DNA 條帶為多態性狀，有性狀記為1，無性狀記為0，并轉換為對應數字矩陣。用NTSYSpc2.1 版軟件包（Exeter Software：Setauket，NY，USA），UPGMA 法聚類分析，獲得親緣關系樹狀圖。

2 結果與分析

2.1 RAPD 多態性分析

用篩選出的12 個隨機引物對6 種供試材料進行RAPD 多態性分析。結果顯示，引物與供試材料在不同對應水平上的擴增效果均存在差異，（圖1）。每一引物對每種供試材料擴增的條帶數介于0～15 條，DNA 片段的大小介于0.2～2.0 kb，12 個引物對6 種供試材料擴增產生近91 條DNA片段。這些數據用于對6 種靈芝菌株進行相似性分析并構建親緣關系樹。

圖1 6 種靈芝菌株的RAPD-PCR 圖譜

2.2 聚類分析

依照1.3 的方法，將6 種靈芝分析獲得的RAPD－PCR 圖譜轉換為數字矩陣，計算對應分離菌株間的Dice 相似系數，得出6 種靈芝菌株的平均遺傳距離矩陣（見表3），6 種靈芝菌株兩兩間的相似性系數為0. 396～0. 747。其中Ganodermasinenses 和Ganodermaatrum 的相似系數最高，達0. 747；而Xuezhi 和Coriolusversicolor 的相似系數最低，為0.396。用UPGMA 法進行聚類分析。結果顯示，6 種菌株在相似性系數為0. 584 的水平上聚為3 類：Ganodermaluidun、Ganodermaluidum-HG、Ganodermasinenses 和Ganodermaatrum 為一類；Xuezhi和Coriolusversicolor各單歸為一類。

表3 6 種靈芝菌株的平均遺傳相似性距離矩陣

2.3 18SrDNA 序列分析

6 種靈芝菌株的18SrDNA 擴增片段，其測序結果通過DNASTAR 軟件包中的MegAlign 程序進行序列分析（見圖2）。結果表明，不同靈芝菌株間相似性都比較高（97.1%～99.6%），其中Xuezhi和GanodermaluidumHG 相似性最高，達99. 6 %；在較低相似性水平上，6 種靈芝菌株可分為3 類，Ganodermaluidun、Ganodermaatrum 和Coriolusversicolor歸為一類，GanodermaluidumHG 和Xuezhi歸為一類，Ganodermasinenses單歸為一類。

圖2 6 種靈芝菌株的18SrDNA 序列比較的系統進化樹

2.4 ITS 序列分析

4 種靈芝菌株的ITS 片段測序成功，測序結果通過DNASTAR 軟件包中的MegAlign 程序進行序列分析（見圖3）。結果表明，靈芝菌株間相似性較低（43. 8 %～88. 0 %），其中Ganodermasinenses 和Xuezhi 相似性最低，為43. 8 %；在較低相似性水平上，Ganodermaluidun 和Ganodermasinenses 歸為一類，Coriolusversicolor 和Xuezhi 各單歸為一類。

圖3 4 種靈芝菌株的ITS 序列比較的系統進化樹

3 討論

RAPD 在真菌分類研究中已有廣泛的應用，據不完全統計，RAPD 已在鏈格孢屬（Alternaria）、葡萄孢屬（Botrytis）、發癬菌屬（Tnchophyton）、芽枝霉屬（Cladosporium）、炭疽菌屬（Colletotrichum）、頂囊殼屬（Gaeumannomyces）、組織胞漿菌屬（Histoplasma）、球腔菌屬（Mycosphaerella）、莖點霉屬（Phoma）、側耳屬（Pleurotus）、絲核菌屬（Rhizoctonia）、腥黑粉菌屬（Tilletia）等50 余個屬的種類區分或疑難種鑒定上得到應用［9］。RAPD 技術已經成功用于一些靈芝屬不同種的區分，趙明文等［6］利用RAPD 技術對生產中常用的靈芝屬8 個菌株的親緣關系進行了分析，結果與經典分類結果基本相符。唐傳紅等［10］也證實了RAPD 可用于靈芝屬內甚至種內的鑒定。本研究中，通過優化篩選12 個隨機引物對6 個菌株進行RAPD 分析，結果顯示，6 種菌株在相似性系數為0. 584 的水平上聚為3 類：Ganodermaluidun、GanodermaluidumHG、Ganodermasinenses 和Ganodermaatrum 為一類；Xuezhi 和Coriolusversicolor 各單歸為一類。

ITS 序列分析是真菌分類研究中最常用方法之一。J. M. Moncalvo 等［3］和B. J. Smith 等［11］通過ITS 序列分析對靈芝屬菌株進行了一些分類研究，證實了ITS 序列分析是一種有效方法。在本研究中，ITS 序列分析的3 個類群（Ganodermaluidun/Ganodermasinenses、Coriolusversicolor 和Xuezhi）與RAPD 分析的3 個類群（Ganodermaluidun/GanodermaluidumHG/Ganodermasinenses/Ganodermaatrum、Coriolusversicolor 和Xuezhi）基本一致，其中，屬于多孔菌科云芝屬的Coriolusversicolor 與屬于靈芝屬的Ganodermaluidun、Ganodermaluidum-HG、Ganodermasinenses 和Ganodermaatrum 與傳統形態學分類基本一致，而分類地位不明的Xuezhi與其他菌株差異性較大，說明Xuezhi 應屬于靈芝屬與云芝屬以外其他屬類。

目前普遍認為18SrDNA 可用于科級以上水平的系統發育分析，如鄧旺秋等［12］以短裙竹蓀和白鬼筆作為鬼筆目的代表種，將其部分18SrDNA序列與擔子菌門其他科目12 個代表種已知的相關序列進行對比分析，構建系統樹，探討鬼筆目在系統分類學中的地位及其親緣關系。考慮到某些物種的18SrDNA 可能具有其他物種所沒有的高度變異擴展區，而這些區域又是用于近緣種間關系分析與分類的關鍵，因此有學者認為，在亞族和屬的水平上處理系統關系也能得出理想結果［13］，如余知和等［14］利用18SrRNA 基因核苷酸序列分析方法探討了晶杯菌科粒毛盤菌屬及其相關屬間的系統發育關系。據此，本研究嘗試對分屬于靈芝屬（Ganodermaluidun、Ganodermaatrum、GanodermaluidumHG 和Ganodermasinenses）、云芝屬（Coriolusversicolor）和分類地位不明的Xuezhi 6種菌株進行18SrDNA 序列分析，結果顯示，在較低相似性水平上，6 種靈芝菌株可分為3 類，Ganodermaluidun、Ganodermaatrum 和Coriolusversicolor歸為一類，GanodermaluidumHG 和Xuezhi歸為一類，Ganodermasinenses單歸為一類。18SrDNA分析的3 個分類群與另外兩種方法的分析結果有很大差異，可以說明，18SrDNA 并不太適合靈芝屬屬內和屬間的分類研究。不可否認，RAPD 和ITS 分子標記各自也存在一些缺點，但在本研究兩者分析結果基本一致的基礎上，可以考慮在靈芝屬的分類研究中將兩種技術結合起來，較之于單一技術，會更接近于實際情況。

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［4］ 蘇春麗，唐傳紅，張勁松. 基于β－微管蛋白基因部分序列探討靈芝屬菌株的親緣關系［J］. 菌物學報，2006，25（3）：439－445.

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