雞心包積液綜合征（安卡拉病）病原分離檢測

常維山 王濤

禽腺病毒（Fowl adenovirus，FAV）是一種無囊膜的雙鏈DNA病毒，衣殼呈規則的20面體結構，直徑約80～110nm，可分為I，Ⅱ，Ⅲ三群，其中I群FAV有12個血清型（FAVI～12），I群FAV具有共同的群抗原，比較著名的病毒株有雞包涵體肝炎病毒，胚致死孤兒病毒（CEIO virus）等，產蛋下降綜合征病毒屬于Ⅲ群，其中I群FAV中C種FAV-4型認為是引起雞心包積液綜合征的病原。本病對3～6周齡肉仔雞易感，潛伏期短、發病快。感染雞群突然出現大批死亡，剖檢發現心包積水、肝細胞有嗜堿性核內包涵體，以及用透射電鏡在感染的肝細胞核內觀察到有腺病毒顆粒。本實驗采取病死雞肝、心、腎臟進行病理組織學觀察，可見形狀不規則的嗜酸性或嗜堿性包涵體。同時取疑似雞心包積液綜合征病死雞的肝組織粗提DNA，設計引物對DNA進行PCR擴增和基因測序分析，同時最后接種雛雞，雛雞一周后出現死亡，用相同方法獲取組織DNA后進行PCR檢測，可發現相同條帶，表明成功建立雞心包積液綜合征（安卡拉病）病原分離檢測方法。

1 流行病學

本病主要開始發生于1～3周齡的肉雞、817、麻雞，也可見于肉種雞和蛋雞，其中以3-7周齡的雞發病較多。因首次發現于巴基斯坦卡拉奇靠近安卡拉的地方，故又名安卡拉病（Angrara disease）。發病雞群多于3周齡開始死亡，4～5周齡達高峰，高峰持續期4～8d，5～6周齡死亡減少。病程8～15d，死亡率達20%-80%，一般在30%左右。發病雞無明顯先兆而突然倒地，沉郁，羽毛成束，出現呼吸道癥狀，甩鼻、呼吸加快，排黃色稀糞，有神經癥狀，兩腿劃空。本病主要垂直傳播，也可水平傳播。雞感染后可成為終身帶毒者，并可間歇性排毒。

2 解剖及病理組織檢測

心臟部位形成淡黃色透明的心包積液，且肝臟有病理壞死現象（見P93，圖1）。

采集發病活雞肝心腎組織器官，經4%甲醛固定后制作石蠟切片，觀察病理組織學變化，主要病理組織學變化表現在肝臟，可見肝臟充血、出血和肝細胞脂肪變性，肝細胞核內可見形狀不規則的嗜酸性或嗜堿性包涵體（見P93，如圖2）。

3 病原PCR檢測

3.1 引物設計與合成

根據Genbank中I群禽腺病毒FAV-4型（AY581297.1）六鄰體基因序列，應用Premier5.0設計FAV-4型引物（由上海生工公司合成）。本實驗中所使用的引物（見表1）。

3.2 病原DNA的提取及PCR擴增

準備2個滅菌1.5mL EP管，每管按1：1加肝組織勻漿與滅菌ddH20，8000r/min離心4min收集上清液，按1：1加入分析純氯仿靜置10min后8000r/min離心5min，吸取上清液直接PCR，采用 25μL PCR體系：DNA樣本1μL；10×PCRBuffer（Mg2+add）2.5μL；dNTP（2.5μmoVL）2μL；引物F/R各0.5μL；Taq酶（5U/μL）0.5μL；滅菌ddH₂018μL。

Buffer、dNTP、Taq酶均購自全式金，94℃5min；94℃45s變性；57℃45s；72℃45s，35個循環擴增；72℃延伸10min，4℃保存。反應結束后取全部PCR產物25μL、Trans 2000 DNA marker對照，0.8%瓊脂糖凝膠電泳，觀察擴增片段大小（圖3）。

3.3 PCR產物序列測定

25μL體系PCR后0.8%瓊脂糖凝膠中空膠電泳，將目的條帶切膠回收后與pMD18-T載體（購自Takara公司）進行連接，連接體系：目的條帶5μL；solution I 4.2μL；T載體0.8μL。

16℃于PCR儀中連接30min，然后將連接產物10μL轉化進50μL的Transl-T1感受態細胞（購自Trans），冰浴30 min后熱激90s，緊接冷敷3min，加800μLLB震蕩培養th后6000r/min離心1min沉淀菌體，留100μL菌液涂布于Amp抗性的平板中37℃培養10h，挑取單菌落接種于Amp抗性的5mL LB液體試管培養基后37℃震蕩培養過夜（220rpm/min），然后將菌液送生工公司測序，測序結果應用DNA star軟件MegAlign的Clustal W方法與FAV-4基因進行序列比對，在送測序列中發現和295bp擴增目的片段一致的序列，表明于病雞肝臟成功檢測到FAV-4型腺病毒。

3.4 病原接種試驗

將病理肝組織與滅菌生理鹽水勻漿攪勻后給雛雞口服0.5mL勻漿液，此后于37℃恒溫飼養，雛雞一周后出現死亡，取死亡雞肝臟組織用以上相同方法獲取組織DNA后進行PCR檢測，可發現相同條帶（如圖4）。