莪術醇β—環糊精包合物對Bel—7404肝癌細胞體外抑瘤作用和細胞周期影響的研究

龔玲等

[摘要] 目的 探討莪術醇β-環糊精包合物作用對肝癌細胞的增殖與凋亡及細胞周期的影響及其分子機制。 方法 采用不同濃度莪術醇β-環糊精包合物處理肝癌Bel-7404細胞后，噻唑藍[3-（4，5）-dimethylthiahiazo （-z-y1）-3，5-di-phenytetrazoliumromide， MTT]比色法測定細胞增殖，流式細胞儀檢測細胞周期與凋亡情況。Western blot檢測細胞周期調控相關基因的表達水平。 結果 MTT法檢測結果顯示，與對照組比較，莪術醇β-環糊精包合物各劑量組生長抑制率均明顯升高，呈劑量與時間依賴性，差異有統計學意義（P<0.05）。流式細胞術檢測結果顯示，莪術醇β-環糊精包合物處理促進細胞凋亡（P<0.05），并使細胞阻滯在G0/G1期（P<0.05），伴隨p21WAF1及p27KIP1的表達水平升高。 結論 莪術醇β-環糊精包合物能夠抑制肝癌細胞Bel-7404的增殖，促進凋亡，并通過上調p21WAF1及p27KIP1基因的表達而誘導G1期阻滯。

[關鍵詞] 肝癌；莪術醇；β-環糊精；細胞周期阻滯

[中圖分類號] R285 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）16-0011-04

[Abstract] Objective To investigate the effects and mechanisms of curcumol-β-cyclodextrin inclusion compound on the proliferation， apoptosis， and cell cycle of human hepatocarcinoma cell line Bel-7404. Methods The effects of different dose of curcumol-β-cyclodextrin inclusion compound on proliferation of human hepatocarcinoma cell line Bel-7404 in vitro was analyzed by MTT assay（P<0.05）. The cell cycles and apoptosis were detected by flow cytometer（P<0.05）. Expression of cycle regulation-related genes were assessed by Western blot. Results Compared with control groups， MTT results showed that curcumol-β-cyclodextrin inclusion compound significantly inhibited the proliferation of Bel-7404 cells in a dose- and time-dependent manner. The results of flow cytometry showed that curcumol-β-cyclodextrin inclusion compound resulted in the cell cycle arrest at G0/G1 phase and increased the apoptotic cell fraction（P<0.05）. Western blotting results showed that curcumol-β-cyclodextrin inclusion compound increased the expression of p21WAF1 and p27KIP1. Conclusion Curcumol-β-cyclodextrin inclusion compound inhibits the growth and induces apoptosis and G0/G1 phase arrest of Bel-7404 in vitro. The mechanisms of G1 arrest may be related to the regulation of the p21WAF1 and p27KIP1.

[Key words] Hepatocarcinoma； Curcumol； β-cyclodextrin； Cell cycle arrest

原發性肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，一旦確診多數患者已為晚期，喪失手術治療的最佳時機[1]。盡管肝癌的綜合治療措施不斷發展完善，但目前肝癌患者的預后極差。因此，開發治療效果好、毒副作用小的抗腫瘤治療藥物，從而進一步提高肝癌的治療效果，是臨床和基礎研究的重點。已有的大量研究表明，中醫藥在腫瘤治療方面有著獨特、高效、低毒的優勢[2]。莪術醇，又名姜黃環奧醇，是從傳統中藥莪術揮發油中提取出來的倍半萜類化合物。已有研究發現，莪術醇能夠以劑量依賴的方式抑制肝癌、卵巢癌等惡性腫瘤細胞的增殖，表明莪術醇具有開發應用的前景[3]。但莪術醇水溶性不佳，限制了其在臨床與基礎研究里的應用價值。如何提高其水溶性是當前研究的熱點。β-環糊精是一種常用的藥物輔料，具有良好的水溶性和增溶效果，其安全性已被廣泛認可[4]。β-環糊精的作用機制是通過將水溶性差的分子包入其疏水性空腔中，進而形成水溶性包合物，以提高藥物的溶解性能，增加藥物的生物利用度。我們之前的研究中制備的莪術醇與β-環糊精的包合物，較莪術醇的溶解度提高了10.3倍。有關體外抗腫瘤活性研究發現，莪術醇β-環糊精包合物可明顯抑制食管癌細胞增殖并誘導凋亡[5]。本研究在此基礎上，于2014年6～12月進一步觀察莪術醇β-環糊精包合物對人肝癌Bel-7404細胞的抑制效果，并探討其對細胞周期及其細胞周期調控基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑來源

莪術醇（中國藥品生物制品檢定所）；MTT（美國Invitrogen公司）；β-環糊精（天津市光復精細化工研究所）；DMEM培養基（美國Gibco公司）；兔抗人p21單克隆抗體（美國CST公司）；兔抗人p27單克隆抗體（美國CST公司）；胎牛血清（美國Gibco公司）；Annexin V-FITC-PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技發展公司）。

1.2 細胞培養

Bel-7404人肝癌細胞株購于美國ATCC細胞庫，細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基，在37℃、5%CO2條件下傳代培養。取對數生長期狀態良好的細胞進行以下實驗。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 MTT法測定肝癌細胞增殖情況 取對數生長期的細胞以104個細胞/孔的密度接種于96孔培養板中。培養24 h后，分別加入終濃度為25、50、100 mg/L莪術醇β-環糊精包合物培養液100 μL，每組設置3個復孔。分別培養48 h與72 h后，每孔分別加入MTT溶液50 μL（5 g/L），37℃繼續培養4 h后結束培養。然后，每孔加入150 μL DMSO，放于搖床振蕩10 min，在酶標儀在570 nm處測定每孔的吸光值（A）。實驗重復3次取平均值，并計算相應的生長抑制率。公式：生長抑制率（%）=（1-藥物組A值/對照組A值）×100%。

1.3.2 細胞凋亡檢測 根據細胞凋亡檢測試劑盒說明，經莪術醇β-環糊精包合物處理48 h 后，胰酶消化，收集各組細胞。用PBS洗滌細胞2次，分別加入1×Binding Buffer 500 μL懸浮細胞，然后各加入5 μL PI與5 μL Annexin V-FITC充分混勻后，室溫、靜置15 min，流式細胞儀上檢測。

1.3.3 細胞周期檢測 Bel-7404細胞經25、50、100 mg/L莪術醇β-環糊精包合物處理48 h后，分別收集細胞，PBS洗滌細胞2次，于4℃、70%乙醇固定24 h。PBS洗3次后，加入Tris-HCl緩沖液，37℃避光孵育30 min，加入50 μg/mL的PI進行細胞DNA染色。采用流式細胞儀檢測細胞周期，分別計算處于各期的細胞所占比例。

1.3.4 Western blot法檢測細胞周期蛋白的表達 Bel-7404細胞經不同濃度莪術醇β-環糊精包合物處理48 h后，收集細胞，提取細胞總蛋白。取煮沸后的蛋白樣品50 μg，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后轉移至硝酸纖維素膜。室溫封閉2 h，分別加入兔抗人p21與p27單克隆抗體（1∶1000）4℃過夜。充分洗滌后，加入1∶3000稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗，37℃孵育2 h。采用增強化學發光法顯色檢測特異條帶，并以GAPDH作為內參對照。

1.4 統計學分析

采用SPSS19.0統計學軟件進行分析，計量資料以（x±s）表示。多樣本均數比較采用單因素方差分析，樣本間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 莪術醇β-環糊精包合物處理對細胞增殖能力的影響

經不同濃度莪術醇β-環糊精包合物處理Bel-7404細胞48 h與72 h后，細胞增殖能力下降，見圖1。25、50、100 mg/L濃度的莪術醇β-環糊精包合物處理48 h后，Bel-7404細胞的抑制率分別為（14.41±1.32）%，（27.38±1.05）%與（34.75±1.49）%，隨著藥物濃度的增加，細胞增殖明顯受到抑制，有明顯的劑量依賴性（F=38.75，P<0.05）。各濃度作用72 h后，Bel-7404細胞的抑制率分別為（18.99±1.62）%，（34.89±2.38）%與（44.24±1.83）%，有明顯的劑量依賴性（F=64.99，P<0.01），提示莪術醇β-環糊精包合物能夠以時間與劑量依賴的方式抑制肝癌細胞Bel-7404的增殖。

2.2 莪術醇β-環糊精包合物對細胞凋亡的影響

通過不同濃度莪術醇β-環糊精包合物處理48 h后，25、50、100 mg/L濃度組細胞經流式細胞儀檢測可見凋亡率分別為（4.29±0.77）%，（9.41±1.56）%，（16.38±1.05）%，（23.75±1.98）%，莪術醇β-環糊精包合物作用后肝癌細胞的凋亡率明顯增加，并且隨莪術醇β-環糊精包合物的劑量增加而增加（F=74.37，P<0.01）。提示莪術醇β-環糊精包合物能夠以劑量依賴的方式誘導肝癌細胞凋亡。

2.3 莪術醇β-環糊精包合物處理對細胞周期的影響

采用不同濃度莪術醇β-環糊精包合物處理48 h后，Bel-7404細胞周期分布出現明顯變化，見表1。不同濃度莪術醇β-環糊精包合物處理后可引起G2/M期（F=18.68，P<0.05）與S期的細胞比例逐漸減少（F=18.12，P<0.05），而G0/G1期的細胞比例逐漸增加（F=88.01，P<0.01）。提示莪術醇β-環糊精包合物可導致Bel-7404細胞出現G0/G1期細胞阻滯，且在（25～100）mg/L濃度范圍內隨著莪術醇β-環糊精包合物濃度增加，其阻滯作用增強。

2.4 莪術醇β-環糊精包合物處理對細胞周期調控基因表達的影響

采用Western blot檢測莪術醇處理48 h后Bel-7404細胞中p21WAF1與p27KIP1蛋白水平。結果顯示，經莪術醇β-環糊精包合處理，細胞的p21WAF1與p27KIP1蛋白的表達水平較對照組明顯升高，見圖2。提示細胞周期負性調控因子p21WAF1與p27KIP1參與了莪術醇β-環糊精包合物所誘導的細胞周期阻滯。

3 討論

莪術醇是從中藥莪術中分離得到的單體化合物，具有高效低毒的特點，作為傳統的抗腫瘤藥物，近年來被試用于治療腫瘤并取得一定成效[6，7]。但由于其水溶性極低，限制了開發與應用。為增加莪術醇的水溶性，研究人員進行了多種嘗試。β-環糊精是一種安全有效的藥物增溶劑，能夠增加藥物的溶解度和利用度。我們已經發現，莪術醇β-環糊精包合物水溶性增加，并具有體外抗食管癌作用。

在此基礎上，我們研究了莪術醇β-環糊精合成的包合物的體外抗肝癌細胞活性。研究結果表明，包合物可顯著抑制肝癌細胞的增殖，并誘導細胞凋亡。進一步的細胞周期分析發現，莪術醇β-環糊精包和物有誘導明顯的G0/G1期阻滯，提示莪術醇β-環糊精包和物抗肝癌機制，可能與誘導凋亡與細胞周期阻滯有關。

增殖與凋亡的異常是惡性腫瘤的顯著特征，抑制腫瘤細胞增殖并誘導凋亡是目前腫瘤藥物研發的關鍵，也是評估抗腫瘤藥物效果的重要指標[8，9]。大量的體外研究已證實，誘導腫瘤細胞凋亡是莪術醇發揮抗腫瘤作用的重要機制[10，11]。莪術醇β-環糊精包和物可明顯抑制肝癌細胞的增殖并誘導凋亡，提示其可能成為抗肝癌治療的候選藥物。

細胞周期正常運行受到細胞周期蛋白（cyclin）、周期蛋白依賴性激酶（CDK）和CDK抑制物（CDKI）等多種調控因子的調節。真核細胞內主要存在3個檢查點（check point）：G1/S 期、G2/M期及紡錘體裝配檢查點，檢查點的異常導致細胞周期紊亂，細胞增殖失控，發生癌變[12，13]。CDK是細胞周期檢查點的效應器，推動細胞通過檢查點。CDK的活性受到cyclin的調控[14，15]。CDK在細胞周期特定的時間與特異的cyclin結合，形成cyclin-CDK復合物，并磷酸化細胞中多種蛋白質底物，從而推動細胞周期向下一階段的運行。p21WAF1和p27KIP1均為CDKI家族在G1期的重要負調控因子，對多種G1和S期的cyclin-CDK復合物均有抑制作用，使細胞周期阻滯于G1期[16]。本研究采用Western blot檢測發現，莪術醇β-環糊精包和物能夠顯著升高p21WAF1和p27KIP1的表達，從而引起G1期阻滯。

綜上所述，莪術醇β-環糊精包合物能夠抑制肝癌細胞Bel-7404的增殖，其機制可能是通過誘導細胞凋亡，通過上調p21WAF1及p27KIP1的表達，引起 G1期阻滯來實現的。

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（收稿日期：2015-02-02）