應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光RT—PCR法檢測(cè)水產(chǎn)品中諾如病毒

紀(jì)衍瑾 孫雯雯 祝喆 楊松濤

[摘要] 目的 建立水產(chǎn)品樣品中的諾如病毒檢測(cè)方法。 方法 優(yōu)化甘氨酸緩沖液處理水產(chǎn)品勻漿液，摸索PEG沉淀濃縮病毒的濃度，提取病毒RNA，采用熒光定量RT-PCR方法進(jìn)行諾如病毒檢測(cè)。 結(jié)果 應(yīng)用優(yōu)化后的方法檢測(cè)72份樣品，并用核苷酸序列測(cè)定法對(duì)陽(yáng)性PCR產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證，所得陽(yáng)性PCR產(chǎn)物經(jīng)核苷酸序列測(cè)序證實(shí)為諾如病毒。 結(jié)論 本研究方法可以應(yīng)用于水產(chǎn)品中的諾如病毒檢測(cè)，撫順市海鮮市場(chǎng)上的水產(chǎn)品很少存在諾如病毒的污染。

[關(guān)鍵詞] 諾如病毒；水產(chǎn)品；富集；熒光定量RT-PCR

[中圖分類號(hào)] R450 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2015）19-0130-03

諾如病毒（norovirus，NoV）是引起兒童急性胃腸炎的主要誘因，可出現(xiàn)食物腹瀉、嘔吐、頭痛、腹痛和發(fā)熱等中毒癥狀，在世界公共衛(wèi)生安全中嚴(yán)重威脅著人類的生命安全[1]。最初，在檢測(cè)諾如病毒的過(guò)程中，檢測(cè)方法有很大的局限性，人們對(duì)諾如病毒對(duì)人類所能造成的影響和危害缺少正確的認(rèn)識(shí)，并且低估了諾如病毒所能造成的危害性。

諾如病毒屬于人類杯狀病毒科，呈球形，無(wú)包膜，可通過(guò)人-人直接接觸傳播、食物性傳播（生吃海產(chǎn)品尤為主要）、水源性傳播等多種傳播途徑傳播[3]。諾如病毒有高度的變異性，在同一時(shí)期、同一地區(qū)就可能存在不同遺傳特性的毒株。諾如病毒抗體保護(hù)力弱，不能實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期免疫保護(hù)，所以非常易造成反復(fù)感染。食品和飲料很容易被諾如病毒感染，100個(gè)病毒就能造成人們發(fā)病。諾如病毒在體外很難繁殖，如果一遇到食品和水，極易引起人們發(fā)病。當(dāng)人們生食或食用加熱不徹底的貝類時(shí)，也可能受到感染，近年來(lái)有很多外國(guó)媒體已報(bào)道，許多胃腸炎暴發(fā)疫情都與生吃牡蠣等貝類食物有關(guān)[3，4]。另外，有些產(chǎn)品比如色拉和冰凍水果也可能在來(lái)源地被污染，進(jìn)而引起人們發(fā)病。2012年，德國(guó)有1萬(wàn)多名小學(xué)生和托兒所的兒童在學(xué)校疑似吃了中國(guó)進(jìn)口的冷凍草莓而發(fā)生食物中毒。后來(lái)，由羅勃特科赫研究院在一包草莓樣品中檢測(cè)到可引起非細(xì)菌性胃腸炎的諾如病毒[5]。由于諾如病毒在食物中含量很低，因此，在檢測(cè)各類樣品時(shí)，還應(yīng)考慮到諾如病毒感染樣品的復(fù)雜性、病毒的高度變異性和混合感染等因素，尤其是在對(duì)蛋白、脂類等PCR反應(yīng)抑制物含量高的食品樣品的前處理上以及檢測(cè)混合感染的細(xì)菌或其它病毒、濃縮低含量樣品、降低假陽(yáng)性率等方面要多加注意，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)性和可靠性[6-8]。

1 材料與方法

1.1樣品的運(yùn)輸與保存

標(biāo)本采集后確保在2 h內(nèi)完成轉(zhuǎn)運(yùn)，運(yùn)輸過(guò)程中使用冰袋進(jìn)行冷藏，使樣品所處溫度在0℃～5℃。病毒在4℃保存不可超過(guò)3 d，因而實(shí)驗(yàn)室收到樣品后應(yīng)盡快進(jìn)行檢測(cè)，如不能及時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，需將樣品置于-20℃保存，如能置于-70℃超低溫冰箱中冷凍保存最好。

1.2 儀器與試劑

NuAire NU425-400E Ⅱ級(jí)生物安全柜（美國(guó)），貝克曼Microfuge22R冷凍離心機(jī)（美國(guó)），ABI 7500Fast全自動(dòng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)），海爾低溫冰箱，Heidolph漩渦振蕩器（德國(guó)），RNeasy Mini Kit核酸提取盒（德國(guó)QIAGEN公司），1.5 mL無(wú)核酸離心管，甘氨酸緩沖液，PEG8000，組織勻漿器（美國(guó)Thremo公司），100～1000 μL可調(diào)移液器。

1.3病毒提取的預(yù)處理（病毒的富集）

無(wú)菌取樣，在5 g檢樣中加入35 mL甘氨酸緩沖液（樣品重量與緩沖液體積之比為1∶7）；組織勻漿器中高速勻漿3 min，充分破碎混勻；將所有均質(zhì)液轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中，37℃孵育30 min或室溫下振蕩30 min；4℃，10000×g離心30 min；取上清，加入10 mL氯仿，充分振搖，放置10 min，中間振搖一次，4℃，10000×g離心30 min；取上清至另一清潔的100 mL離心管中，加入等體積的PEG 8000溶液（PEG終濃度為8%），上下顛倒離心管以充分混勻；冰浴：冰上放置至少1 h，4℃，10000×g離心5 min。棄去上清，保留沉淀。

1.4 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)體系

本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，RT-PCR 反應(yīng)體系采用中山達(dá)安基因生物公司的商品化病毒核酸檢測(cè)試劑盒（PCR熒光探針?lè)℅Ⅱ型），PCR反應(yīng)操作流程嚴(yán)格按照試劑盒使用說(shuō)明書進(jìn)行。本試劑盒適用于諾沃克病毒GⅡ型的病毒核酸檢測(cè)。體系配制參考試劑說(shuō)明書。反應(yīng)條件：50℃，15 min，1個(gè)循環(huán)→95℃，15 min，1個(gè)循環(huán)→94℃，15 s，55℃，45 s（收集熒光），45個(gè)循環(huán)。

1.5 判定標(biāo)準(zhǔn)

以試劑提供的諾如病毒陽(yáng)性質(zhì)控品為陽(yáng)性對(duì)照，以試劑提供的陰性質(zhì)控品作為陰性對(duì)照。所檢測(cè)樣品的Ct值≤30時(shí)，且擴(kuò)增曲線有明顯對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，則測(cè)定結(jié)果有效，可直接報(bào)告樣品為陽(yáng)性；若3035時(shí)，可報(bào)告樣品為陰性。

2 結(jié)果

通過(guò)檢測(cè)2014年1～12月期間撫順市各水產(chǎn)品經(jīng)銷處貝類樣品72份，對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行分析，可以發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性對(duì)照的Ct值為19且曲線有明顯對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，而所采集的樣品的檢測(cè)結(jié)果均無(wú)擴(kuò)增曲線，所采集樣品中未發(fā)現(xiàn)GⅡ型諾如病毒呈陽(yáng)性的樣品。以1月份所采集樣品的PCR檢測(cè)結(jié)果為例見圖1，檢測(cè)數(shù)據(jù)見表1。

圖1 2014年1月所采集樣品檢的測(cè)結(jié)果

將該方法應(yīng)用于2014年1～12月從撫順市海鮮市場(chǎng)上購(gòu)買的72份海產(chǎn)品（包括牡蠣46份、生蠔10份、扇貝8份、蟶子8份）樣本檢測(cè)，所檢測(cè)樣品中無(wú)GⅡ型諾如病毒陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性對(duì)照有明顯的擴(kuò)增曲線，說(shuō)明該方法可應(yīng)用于海產(chǎn)品樣品中諾如病毒的核酸檢測(cè)，也提示撫順市海鮮市場(chǎng)上的海產(chǎn)品很少存在諾如病毒的污染。

3 討論

諾如病毒可通過(guò)多種途徑傳播，是成人、嬰幼兒以及兒童發(fā)生急性胃腸炎的主要病原之一[6]。“諾如病毒”感染性腹瀉屬于自限性疾病，沒(méi)有疫苗和特效藥物，公眾搞好個(gè)人衛(wèi)生、食品衛(wèi)生和飲水衛(wèi)生是預(yù)防本病的關(guān)鍵，要養(yǎng)成勤洗手、不喝生水、生熟食物分開、避免交叉污染等健康生活習(xí)慣。目前，科學(xué)家已對(duì)上百種諾如病毒進(jìn)行基因測(cè)序[9]。本研究結(jié)果表明，出現(xiàn)的地區(qū)不同，流行時(shí)間不同的諾如病毒基因序列比較保守一些。許多流行病學(xué)研究提示GⅡ型諾如病毒在急性胃腸炎感染中占主要地位，并且GⅡ4型為最常見，而GⅡ4/2006b型是目前的流行株[10-12]。

Jiang X的研究團(tuán)隊(duì)在1992年成功研究出檢測(cè)諾如病毒的RT-PCR方法。目前諾如病毒的檢測(cè)方法主要是ELISA法、常規(guī)RT-PCR法和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法[13]。如今，常規(guī)RT-PCR技術(shù)易于操作，靈敏度較高，是目前檢測(cè)諾如病毒應(yīng)用最廣泛的方法，被稱為檢測(cè)諾如病毒的“金標(biāo)準(zhǔn)”。有學(xué)者所用引物為RNA多聚酶區(qū)的JV12/JV13，并對(duì)模擬水樣進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，RT-PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為327 bp，在模擬水樣中檢測(cè)靈敏度為200 ng/L，該實(shí)驗(yàn)所建立的方法對(duì)水質(zhì)控制起到了很好的監(jiān)測(cè)作用。目前，運(yùn)用ELISA法已上市的諾如病毒檢測(cè)試劑盒有IDEIATM Norovirus 試劑盒、Ridascreen Norovirus等。試劑盒相對(duì)于PCR技術(shù)更加簡(jiǎn)單方便，但由于存在抗體抗原的特異性，該方法可能出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果[14，15]。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)敏感性較高，較常規(guī)RT-PCR省時(shí)，逐漸取代了常規(guī)PCR技術(shù)。同時(shí)，也可用于監(jiān)測(cè)水體及貝類中的諾如病毒，保障公共食品衛(wèi)生安全。

本次實(shí)際樣本的檢測(cè)全部為諾如病毒陰性，可能是海產(chǎn)品帶毒率低，也可能與采樣的時(shí)間、采樣溫度及樣品量有關(guān)，需要我們進(jìn)一步進(jìn)行系統(tǒng)監(jiān)測(cè)，以深入了解諾如病毒的分子流行病學(xué)特征，傳播的來(lái)源、途徑及污染的高危食物，為預(yù)防和控制諾如病毒的爆發(fā)和流行提供科學(xué)依據(jù)。

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（收稿日期：2015-04-02）