六味地黃湯對腎間質纖維化大鼠腎組織中缺氧誘導因子—1α和Ⅰ、Ⅲ型膠原表達的影響

唐群等

摘要：目的 探討六味地黃湯抗腎間質纖維化的作用機制。方法 采用5/6腎切除法復制腎間質纖維化大鼠模型，隨機分為假手術組、模型組、六味地黃湯組和依那普利組。六味地黃湯組予6.25 g/（kg·d）六味地黃湯灌胃，依那普利組予10 mg/（kg·d）馬來酸依那普利懸濁液灌胃，假手術組和模型組予10 mL/（kg·d）蒸餾水灌胃，每日1次，連續12周。采用免疫組化法檢測缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）和Ⅰ、Ⅲ型膠原（CollⅠ、CollⅢ）在腎組織中的表達。結果 與假手術組比較，模型組腎組織中HIF-1α、CollⅠ、CollⅢ的表達均明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，六味地黃湯組和依那普利組腎組織中HIF-1α和CollⅠ、CollⅢ的表達均降低（P<0.05），且六味地黃湯組優于依那普利組（P<0.05）。結論 六味地黃湯可能通過下調HIF-1α和CollⅠ、CollⅢ的表達，改善腎組織慢性缺氧，發揮抗腎間質纖維化的作用。

關鍵詞：慢性腎臟病；缺氧誘導因子-1α；Ⅰ型膠原；Ⅲ型膠原；六味地黃湯；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.019

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）04-0067-03

Effects of Liuwei Dihuang Decoction on Expressions of HIF-1α， CollⅠ， and CollⅢ in Renal Interstitial Fibrosis Rats TANG Qun， ZHANG Xi， LEI Jiu-shi， WU Hua， BU Lan-lan （Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China） Abstract：Objective To discuss the mechanism of Liuwei Dihuang Decoction against renal interstitial fibrosis. Methods The rat models of renal interstitial fibrosis were induced by 5/6 nephrectomy， and were randomly divided into sham-operation group， model group， Liuwei Dihuang Decoction group and enalapril group. Liuwei Dihuang Decoction group was given 6.25 g/（kg·d） of Liuwei Dihuang Decoction for gavage， enalapril group was given 10 mg/（kg·d） enalapril for gavage， sham-operation group and model group were given 10 mL/（kg·d） of distilled water for gavage， 1 time per day for 12 weeks. Expressions of HIF-1α， CollI， and CollIII in kidney tissue were detected by immunohistochemistry. Results Compared with the sham-operation group， the expressions of HIF-1α， CollI， and CollIII of renal tissue in the model group significantly increased （P<0.05）. Compared with the model group， Liuwei Dihuang Decoction group and enalapril group can inhibit the expressions of HIF-1α， CollI， and CollIII （P<0.05）， and Liuwei Dihuang Decoction group was better than enalapril group （P<0.05）. Conclusion The mechanism of Liuwei Dihuang Decoction against renal interstitial fibrosis may improve the renal tissue of chronic hypoxia to play the role of preventing renal interstitial fibrosis by decreasing the expressions of HIF-1α， CollI， and CollIII.

Key words：chronic kidney disease；hypoxia-inducible factor 1α；type I collagen；type III collagen；Liuwei Dihuang Decoction；rats

研究表明，缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）在纖維

基金項目：湖南省科學技術廳科技計劃（2013SK3085）；湖南省中醫藥科研計劃項目（2013118）；湖南中醫藥大學重點學科建設項目-病理學與病理生理學（2012年）

化發展過程中起至關重要的作用[1]。慢性缺氧可誘發腎組織HIF-1α持續表達，后者上調一系列促纖維化相關靶基因加重腎損傷[2]，最終導致腎間質纖維化。Ⅰ、Ⅲ型膠原（CollⅠ、CollⅢ）的合成、分泌增多和/或降解減少是細胞外基質（ECM）積聚和腎間質纖維化的主要病理表現。本研究通過觀察六味地黃湯對腎間質纖維化大鼠腎組織中HIF-1α及Ⅰ、Ⅲ型膠原表達的影響，探討其拮抗腎間質纖維化的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

清潔級健康雄性SD大鼠70只，鼠齡4～5周，體質量（180±20）g，湖南中醫藥大學實驗動物中心提供，動物合格證號SCXK（湘）2009-0001，飼養于湖南中醫藥大學SPF級動物房。

1.2 藥物

六味地黃湯（熟地黃24 g、山藥12 g、茯苓9 g、山萸肉12 g、澤瀉9 g、牡丹皮9 g，購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科），將飲片藥材加5倍的自來水浸泡2 h，煮沸后文火煎煮30 min，過濾后收集煎液，剩余的藥渣再加少量水煎煮，得二煎液。將兩煎液混合，在水浴恒溫器上濃縮至含原藥材1 g/mL。馬來酸依那普利片購自湖南千金湘江藥業股份有限公司，批號20130522，每片10 mg加蒸餾水10 mL制成懸濁液，濃度為1 mg/mL。

1.3 主要試劑與儀器

一抗為兔抗大鼠HIF-1α、CollⅠ、CollⅢ多克隆抗體（美國Santa Cruz），兔二步法免疫組化檢測試劑盒（PV-6001）、二抗為山羊抗兔（北京中杉金橋公司），DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物技術有限公司）。SHANDON FINESSE325型石蠟切片機（英國珊頓公司），BA410T生物顯微鏡（德國Motic公司），Motic Medical 6.0數碼顯微圖像分析軟件系統（北京麥克奧迪），微量加樣器（北京吉爾森公司），CS-930雙波長薄層掃描儀（日本島津公司）。

2 實驗方法

2.1 分組與造模

SD雄性大鼠適應性喂養1周后隨機分為假手術組（10只），模型組（20只），六味地黃湯組（20只），依那普利組（20只）。模型組、六味地黃湯組、依那普利組均在無菌條件下進行5/6腎切除術，以10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉動物，常規消毒鋪巾，從左腹部切口，打開腹腔，靜脈夾夾住腎蒂后切除左腎上下極（切除2/3），以明膠海綿壓迫止血，復位腎臟。1周后進行第2次手術，切除右側腎臟。假手術組采取同樣步驟，打開腹腔暴露腎臟后避免牽拉腎臟，但不切除腎臟。

2.2 給藥

造模后第2日，六味地黃湯組予6.25 g/（kg·d）六味地黃湯灌胃，依那普利組予10 mg/（kg·d）馬來酸依那普利懸濁液灌胃，假手術組和模型組均予10 mL/ （kg·d）蒸餾水灌胃，每日1次，連續12周。各組大鼠灌胃中途死亡者直接予以剔除。

2.3 標本收集

各組大鼠分別于造模第12周后予腹主動脈放血處死，腎組織用4%多聚甲醛固定。

2.4 免疫組織化學法檢測

免疫組織化學PV二步法染色，一抗用兔抗大鼠HIF-1α、CollⅠ、CollⅢ抗體，二抗用相應山羊抗兔抗體（工作濃度按產品說明書配制為1∶100），染色呈棕褐色或棕黃色者為陽性染色。Olympus顯微鏡觀察每張切片并隨機選取5個視野，用麥克奧迪數碼醫學分析系統（Motic Med 6.0）進行圖像分析。觀察視野內免疫陽性細胞的平均灰度值，半定量法評估，測得組織細胞平均灰度值愈小，說明其蛋白水平愈高。

3 統計學方法

采用SPSS19.0統計軟件進行分析。計量資料以—x±s表示，多組均數比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LDS-t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 六味地黃湯對大鼠腎組織缺氧誘導因子-1α表達的影響

假手術組腎小管上皮細胞胞漿、核內微量表達；模型組腎小球、間質表達較弱，腎近曲小管、遠曲小管上皮細胞胞漿、核內及管腔面均有大量棕褐色陽性表達；六味地黃湯組和依那普利組腎小球、間質無明顯表達，腎近曲小管、遠曲小管上皮細胞胞漿、胞核及管腔面有深棕黃色或棕黃色陽性表達。經半定量分析，與假手術組比較，模型組、六味地黃湯組和依那普利組HIF-1α表達增強、平均灰度值降低（P<0.05）；與模型組比較，六味地黃湯組和依那普利組HIF-1α表達減弱、平均灰度值升高（P<0.05），且六味地黃湯組優于依那普利組（P<0.05）。結果見圖1、表1。

4.2 六味地黃湯對大鼠腎組織I、Ⅲ型膠原蛋白表達的影響

假手術組腎小球不表達，腎間質及腎小管胞漿、核內微量表達；模型組腎小球表達不明顯，腎間質及腎近曲小管、遠曲小管胞漿、核內及管腔面均有大量棕褐色陽性顆粒；六味地黃湯組和依那普利組腎小球表達均不明顯，腎間質及腎近曲小管、遠曲小管胞漿、胞核及管腔面有深棕黃色或棕黃色陽性顆粒。經半定量分析，與假手術組比較，模型組、六味地黃湯組和依那普利組CollⅠ、CollⅢ表達增強，平均灰度值降低（P<0.05）；與模型組比較，六味地黃湯組和依那普利組CollⅠ、CollⅢ表達減弱，平均灰度值升高（P<0.05），且六味地黃湯組優于依那普利組（P<0.05）。

5 討論

Higgins等[3]研究發現，慢性缺氧可導致腎小管間質損傷，促進腎間質纖維化，而缺氧主要通過HIF-1及其氧敏感元件HIF-1α發揮作用[4]。Kimura等[5]通過應用5/6腎切除基因敲除小鼠模型發現，HIF-1α基因敲除小鼠的腎纖維化程度明顯較野生型對照小鼠輕，同時在單側輸尿管梗阻模型中應用HIF-1α拮抗劑YC-1可明顯減輕小鼠腎間質纖維化，從而推測抑制HIF-1α的表達可能是治療腎臟纖維化的靶點。因此，Haase[6]提出缺氧激活的HIF-1α是導致腎間質纖維化的關鍵因子。正常狀態下，體內纖溶酶原激活物及其抑制物（PAs/PAIs）和基質金屬蛋白酶及其抑制物（MMPs/TIMPs）保持動態平衡。腎臟局部缺血、缺氧及炎癥細胞浸潤時，機體PAs/PAIs和MMPs/TIMPs表達失衡，致使ECM合成增多，降解減少，使大量ECM沉積于腎間質，引起ECM積聚，是導致腎間質纖維化的基本病理生理過程。膠原是ECM最重要的成分，CollⅠ、CollⅢ型是構成腎臟組織結構框架的主要膠原。

腎間質纖維化屬中醫“水腫”“虛勞”等范疇。虛、濁、瘀、毒為腎間質纖維化四大病理機制，其中虛為其根本。六味地黃丸由腎氣丸衍化而來。由熟地黃、山萸肉、山藥、牡丹皮、澤瀉、茯苓組成。依那普利是血管緊張素轉換酶抑制劑類藥物，其不僅可通過降壓、減少尿蛋白保護腎臟，還能通過減少腎小球ECM的蓄積，減少腎間質纖維化和腎小球硬化，延緩腎損害進展。我們前期研究顯示，六味地黃湯可明顯降低5/6腎切除大鼠血尿素氮、肌酐水平，減輕腎組織病理變化，減少間質膠原纖維增生[7]。六味地黃湯可下調5/6腎切除大鼠腎組織內PAI-1、TIMP-1的表達，從而延緩腎間質纖維化[8]。本研究結果顯示，治療組大鼠腎組織HIF-1α、CollⅠ、CollⅢ表達均明顯低于模型組，且治療效果六味地黃湯組優于依那普利組，提示其可能通過恢復PAs/PAIs和MMPs/TIMPs間的網絡平衡，減少ECM中膠原蛋白的合成和/或增加其降解，從而達到減輕或抑制腎間質纖維化進程的目的。

參考文獻：

[1] Pan SY， Chang YT， Lin SL. The role of hypoxia-inducible factors in renal fibrosis[J]. J Formos Med Assoc，2013，112（10）：587-588.

[2] Song YR， You SJ， Lee YM， et al. Activation of hypoxia-inducible factor attenuates renal injury in rat remnant kidney[J]. Nephrol Dial Transplant，2010，25（1）：77-85.

[3] Higgins DF， Kimura K， Iwano M， et al. Hypoxia-inducible factor signaling in the development of tissue fibrosis[J]. Cell Cycle， 2008，7（9）：1128-1132.

[4] Takiyama Y， Harumi T， Watanabe J， et al. Tubular injury in a rat model of type 2 diabetes is prevented by metformin：a possible role of HIF-1α expression and oxygen metabolism[J]. Diabetes， 2011，60（3）：981-992.

[5] Kimura K， Iwano M， Higgins DF， et al. Stable expression of HIF-1alpha in tubular epithelial cells promotes interstitial fibrosis[J]. Am J Physiol Renal Physiol，2008，295（4）：F1023-1029.

[6] Haase VH. Pathophysiological consequences of HIF activation：HIF as a modulator of fibrosis[J]. Ann N Y Acad Sci，2009，1177：57-65.

[7] 唐群，何澤云，徐文峰，等.六味地黃湯對5/6腎切除大鼠腎組織中細胞外基質的影響[J].湖南中醫藥大學學報，2012，32（11）：19-23.

[8] 唐群，何澤云，徐文峰，等.六味地黃丸對5/6腎切除大鼠腎組織中HIF-1α、PAI-1和TIMP-1表達的影響[J].中國中西醫結合腎病雜志， 2012，13（9）：777-780.

（收稿日期：2014-09-27；編輯：華強）