苦杏仁苷對Ⅱ型膠原誘導性關節炎大鼠腫瘤壞死因子—α和細胞間黏附分子—1的影響

羅德梅 單志桂 葛金蓮 劉青 羅莉

摘要：目的 探討苦杏仁苷對Ⅱ型膠原誘導性關節炎（CIA）大鼠的抗炎作用機制。方法 Wistar大鼠隨機分為正常組、模型組、苦杏仁苷組、雷公藤多苷組。采用Ⅱ型膠原誘導建立CIA大鼠模型，造模后第15日，各給藥組予相應藥物灌胃，連續28 d。ELISA檢測大鼠血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、細胞間黏附分子-1（sICAM-1）水平，免疫組化法檢測大鼠關節滑膜TNF-α表達。結果 苦杏仁苷組和雷公藤多苷組關節滑膜TNF-α陽性表達相似，較模型組明顯減少，且苦杏仁苷組和雷公藤多苷組大鼠外周血中TNF-α、sICAM-1水平與模型組比較均明顯下降（P<0.05），與正常組比較差異無統計學意義（P>0.05）。結論 苦杏仁苷通過有效抑制TNF-α、sICAM-1水平及TNF-α表達，達到治療類風濕關節炎的作用。

關鍵詞：苦杏仁苷；Ⅱ型膠原誘導性關節炎；腫瘤壞死因子-α；細胞間黏附分子-1；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.07.021

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）07-0075-03

Effects of Amygdalin on TNF-α and sICAM-1 of Rats with Type II Collagen-induced Arthritis LUO De-mei， SHAN Zhi-gui， GE Jin-lian， LIU Qing， LUO Li （The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University， Urumqi 830011， China）

Abstract：Objective To discuss effects of anti-inflammatory mechanism of amygdalin on rats with type II collagen-induced arthritis （CIA）. Methods Wistar rats were randomized into normal group， model group， amygdalin group， and tripterygium group. Type II CIA rat models were established. From the 15th day after the modeling establishment， each administration group was given corresponding dose of medicine for continuous 28 days. Levels of TNF-α and sICAM-1 were detected by ELISA in serum of rats， and expression of TNF-α was detected by immuno- histochemical method. Results TNF-α positive expression in amygdalin group and tripterygium group was similar and significantly reduced compared with model group. Levels TNF-α and sICAM-1 in amygdalin group and tripterygium group significantly decreased compared with those in model group （P<0.05）， without significant difference compared with normal group （P>0.05）. Conclusion Amygdalin can inhibit the expression of TNF-α and levels of TNF-α and sICAM-1， in order to treat rheumatoid arthritis.

Key words：amygdalin；type II collagen-induced arthritis；TNF-α；sICAM-1；rats

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以關節滑膜慢性炎癥為主要特征的自身免疫性疾病，其確切的病因和發病機理目前尚不明確。苦杏仁苷是苦杏仁中的有效成分，廣泛存在于薔薇科植物的種子中，現代藥理研究表明，其具有抗動脈粥樣硬化、

基金項目：新疆維吾爾自治區自然科學基金（2014211C047）；新疆醫科大學第一附屬醫院藥學專項基金（2012YX06）

通訊作者：羅莉，E-mail：luoli.6@163.com

抗纖維化、免疫調節、抗腫瘤、抗炎等作用[1]。Hwang等[2]采用體外脂多糖（LPS）誘導的細胞系和角叉菜膠誘導的踝關節炎大鼠模型研究顯示，苦杏仁苷對關節炎具有較好的消炎和鎮痛作用。本研究觀察苦杏仁苷對Ⅱ型膠原誘導性關節炎（type Ⅱ collagen induced arthritis，CIA）大鼠干預后大鼠關節滑膜組織病理、滑膜和血清中細胞因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的表達及血清中細胞間黏附分子（sICAM-1）的變化，為臨床防治RA提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級雌性Wistar大鼠45只，7～8周齡，體質量（180±20）g，新疆醫科大學動物實驗中心提供，合格證號IACUC-20130319012。實驗期間飼養于新疆醫科大學第一附屬醫院實驗動物科學研究部，SPF級常規飼養。

1.2 藥物

苦杏仁苷購于成都曼思特生物科技有限公司，批號MUST-13011801；雷公藤多苷片購自于新疆醫科大學第一附屬醫院，遠大醫藥黃石飛云制藥有限公司，批號20130105。

1.3 主要試劑與儀器

牛Ⅱ型膠原（CⅡ），Sigma公司；弗氏完全佐劑，Sigma公司；大鼠TNF-α、sICAM-1定量試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司；脫鈣液，北京中杉金橋生物技術有限公司；TNF-α一抗體，武漢博士德生物工程有限公司；pV二步法免疫組化檢測試劑、PBS緩沖液、抗體稀釋液，北京中杉金橋生物技術有限公司。切片機，德國LEICA RM2135；光學顯微鏡，中國NIKON YS100；顯微照相機，德國LEICA DM3000；孵育溫箱，日本EYELA SLI-700；數顯鼓風干燥箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠。

2 實驗方法

2.1 造模與分組

實驗大鼠適應性喂養1周，隨機選取8只為正常組，其余大鼠參照文獻[3]方法建立膠原誘導的關節炎模型（CIA）。將CⅡ溶于預冷的0.1 mol/L冰醋酸中，終濃度為4 mg/mL，4 ℃過夜。將溶解于冰醋酸CⅡ加入等體積的弗氏完全佐劑在冰浴條件下使二者充分乳化。于大鼠左足跖肉墊及尾根部多點皮內注射CⅡ乳劑0.2 mL/只進行初次免疫，7 d后，使用上述乳劑于足跖及尾根部再次加強免疫。造模14 d后參照文獻[4]進行評估，于致炎第21日剔除未發病大鼠，將造模成功的35只大鼠隨機分為模型組5只、雷公藤多苷組10只及苦杏仁苷高、低劑量組各10只。

2.2 大鼠關節炎癥指數評定

初次免疫后每周對實驗大鼠進行關節炎癥評分（arthritis index，AI），大鼠關節炎表現以0～4分計算，分為5級。0分：無關節炎癥狀；1分：單個爪或趾（指）的紅腫；2分：2個關節受累；3分：2個以上關節受累；4分：全部爪及趾均發生嚴重關節炎。每只大鼠AI為4只包括趾（指）在內的整個爪評分之和。初次免疫第14日后AI≥6分及以上的大鼠提示造模成功，用于實驗。

2.3 給藥及取材

雷公藤多苷組給藥劑量為1 mg/kg，苦杏仁苷組給藥劑量為120 mg/kg，臨用前分別用滅菌蒸餾水配制，給藥體積1 mL/100 g灌胃，正常組、模型組予等量生理鹽水灌胃，每日1次，連續4周。游標卡尺記錄后足踝關節腫脹情況。給藥4周后大鼠稱重，10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉，參照文獻[4]方法，股動脈采血，分離血清，4%多聚甲醛固定分離膝關節滑膜作為病理及免疫組織化染色標本。

2.4 組織病理學觀察

常規乙醇梯度脫水，進行石蠟包埋?切片?HE染色，光學顯微鏡下進行觀察?

2.5 血清腫瘤壞死因子-α和細胞間黏附分子-1測定

ELISA檢測血清TNF-α、sICAM-1，按照試劑盒說明書進行操作。

2.6 免疫組化染色檢測大鼠關節滑膜中腫瘤壞死因子-α表達

切片脫水脫蠟、水化，PBS洗3次×5 min，滴加3%H2O2室溫10 min阻斷內源酶，PBS洗3次×5 min， 0.01 mol/L檸檬酸鹽抗原修復液，微波修復10 min，室溫冷卻，蒸餾水、PBS依次洗1次，各 5 min，加一抗，4 ℃冰箱過夜。將濕盒置于室溫1 h，加二抗，37 ℃溫箱孵育25 min，PBS洗3次，每次5 min。新鮮配置的DAB顯色液進行顯色，檢測滑膜中TNF-α表達?蘇木素復染、鹽酸乙醇分化、返藍、脫水、透明、中性樹膠封片。

3 統計學方法

采用SPSS16.0統計軟件進行分析。實驗數據用 —x±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 膝關節滑膜病理觀察結果

給藥28 d后，鏡下觀察可見正常組大鼠滑膜組織學結構正常，細胞排列清晰，未見增生，無明顯炎性細胞聚集浸潤；模型組大鼠滑膜增厚明顯，排列紊亂，有新生血管生成，大量炎性細胞浸潤；苦杏仁苷組和雷公藤多苷組大鼠滑膜增生，炎性細胞浸潤及血管生成較模型組明顯減輕。

4.2 苦杏仁苷對大鼠關節腫脹程度的影響

與正常組比較，模型組大鼠關節明顯腫脹（P<0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠第7、14、21、28日關節腫脹均減輕（P<0.05），組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。結果見表1。

4.3 苦杏仁苷對大鼠外周血中腫瘤壞死因子-α、細胞間黏附分子-1的影響

給藥28 d后，與模型組比較，苦杏仁苷組、雷公藤多苷組大鼠外周血中TNF-α、sICAM-1水平均明顯下降（P<0.05），與正常組比較差異無統計學意義（P>0.05）。結果見表2。

表2 各組大鼠外周血中TNF-α、sICAM-1水平比較（—x±s，μg/L）

組別 只數 sICAM-1 TNF-α

正常組 8 20.1±0.4 59.2±7.1

模型組 5 22.0±1.5 74.2±8.7

苦杏仁苷組 10 19.6±0.9# 59.3±7.7#

雷公藤多苷組 10 20.4±0.3# 60.2±8.6#

4.4 關節滑膜免疫組化染色觀察結果

給藥28 d后，免疫組化染色顯示，炎性細胞因子TNF-α陽性表達區域呈棕黃色。正常組大鼠關節滑膜中僅見極少量的TNF-α陽性表達；模型組大鼠關節滑膜可見TNF-α陽性表達明顯增多，各給藥組TNF-α陽性表達較模型組明顯減少。結果見圖1。

正常組 模型組 苦杏仁苷組 雷公藤多苷組

圖1 各組大鼠滑膜中TNF-α表達（免疫組化染色，×400）

5 討論

RA屬中醫學“痹證”范疇，目前，研究RA模型包括佐劑性關節炎模型（ajudvant arthritis，AA）和CIA。AA制作方便簡單，可廣泛應用于多種動物，但它與RA差異較大，病變具有自限性。CIA大鼠模型是Trentham等[5]于1977年首次建立，現已公認為是研究RA的經典模型。

TNF-α是RA中重要炎性細胞因子，TNF-α可誘導滑膜細胞產生多種細胞因子，促進滑膜細胞增殖，促進RA滑膜細胞凋亡，引起炎癥反應持續發生并逐漸出現骨侵蝕；ICAM-1是一類黏附分子，為淋巴細胞相關抗原-1的配體，通過介導細胞間、細胞與細胞外基質

間的黏附作用，促進炎癥的發生和發展。雷公藤因具有抗炎、免疫抑制等作用，目前已被用于治療RA等多種自身免疫性疾病，并取得肯定療效，但有一定的不良反應。有文獻報道，苦杏仁苷對AA能夠抑制炎癥，增強巨噬細胞的吞噬功能，具有調節免疫功能的作用，苦杏仁水煎劑對AA大鼠具有軟骨組織破壞減輕，組織學上有明顯改善炎癥程度作用[6]。本實驗結果顯示，大鼠滑膜組織病理切片在模型組顯示滑膜增厚明顯，排列紊亂，有新生血管生成，大量炎性細胞浸潤；給藥組大鼠滑膜增生、炎性細胞浸潤及血管生成較模型組明顯減輕。另外，給藥組大鼠外周血中TNF-α、sICAM-1水平與模型組比較均明顯下降，且給藥組TNF-α陽性表達相似，較模型組明顯減少，提示苦杏仁苷通過抑制TNF-α及sICAM-1的表達，有效抑制CIA大鼠關節腫脹，減輕病理損傷，進而達到抗RA的作用，且療效與雷公藤多苷相似，可為RA的中醫治療用藥及中醫免疫學研究提供一定的啟示。

參考文獻：

[1] Deng JG， Wang HL， Liu YD， et a1. Anti-atherosclerotic effects mediated by the combination of probucol and amygdalin in apolipoprotein e-knockout mice fed with a high fat diet[J]. J An Vet Adv，2012，11（1）：20-25.

[2] Hwang H， Lee H， Kim C， et al. Inhibitory effect of amygdalin on lipopolysaccharide-inducible TNF-α and IL-1β mRNA expression and carrageenan-induced rat arthritis[J]. Journal of Micro-biology and Biotechnology，2008，18（10）：1641-1647.

[3] 李寶麗，唐方，龐曉東.Ⅱ型膠原誘導關節炎大鼠模型制備[J].中國免疫學雜志，2006，22（5）：350-352.

[4] 石磊，李小峰，王彩虹，等.大鼠膠原誘導性關節炎模型的制備及評價[J].臨床醫藥實踐，2011，20（4）：245-247.

[5] Trentham DE， Townes AS， Kang AH. Autoimmunity to type Ⅱ collagen：an experimental model of arthritis[J]. J Exp Med， 1977，146：857-868.

[6] 方偉蓉，李運曼，鐘林霖.苦杏仁苷對佐劑性炎癥影響的實驗研究[J].中國臨床藥理學與治療學雜志，2004，9（30）：289-293.

（收稿日期：2014-12-17；編輯：華強）