化濁顆粒對2型糖尿病大鼠磷脂酰肌醇3激酶和葡萄糖轉運蛋白4基因表達的影響

康學東 李菲 楊維杰 余臣祖

摘要：目的 觀察化濁顆粒對2型糖尿病（T2DM）大鼠磷脂酰肌醇3激酶（PI-3K）、葡萄糖轉運蛋白4（GLUT4）在骨骼肌組織中表達的影響，探討其對PI-3K及GLUT4信號通路激活的作用。方法 采用高脂飼料喂養聯合小劑量鏈脲佐菌素腹腔注射建立T2DM大鼠模型，隨機分為化濁顆粒組、羅格列酮組、模型組。各給藥組給予相應藥物灌胃，模型組與空白組予生理鹽水灌胃，觀察大鼠一般狀態、體質量及攝食量。干預10周后，予10%水合氯醛麻醉大鼠，檢測大鼠空腹血糖（FBG）、葡萄糖耐量試驗餐后2 h血糖（2 h PG）、空腹胰島素（FINS）水平；RT-PCR檢測各組大鼠骨骼肌組織PI-3K和GLUT4 mRNA表達的水平。結果 與模型組比較，化濁顆粒組與羅格列酮組大鼠FBG、2 h PG及FINS水平降低（P<0.05），PI-3K及GLUT4 mRNA表達水平升高（P<0.05）。結論 化濁顆粒具有提高胰島素敏感性的作用，與激活骨骼肌組織胰島素信號傳導通路中PI-3K和GLUT4 mRNA的表達有關。

關鍵詞：化濁顆粒；2型糖尿病；胰島素抵抗；磷脂酰肌醇3激酶；葡萄糖轉運蛋白4；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.07.019

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）07-0067-04

Effects of Huazhuo Granule on Expressions of PI-3K and GLUT4 mRNA in Rats with Type 2 Diabetes KANG Xue-dong1， LI Fei2， YANG Wei-jie1， YU Chen-zu2 （1.The Affiliated Hospital of Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730020， China；2.Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730020， China）

Abstract：Objective To observe the effects of Huazhuo Granule on expression of phosphatidylinositol-3-kinase （PI-3K） and glucose transporter 4 （GLUT4） in skeletal muscle type 2 diabetes （T2DM） rats；To discuss its effects on activating signal path of PI-3K and GLUT4. Methods High-fat diet combined with low-dose streptozotocin intraperitoneal injection was used to establish T2DM rat models. The rats were randomly divided into blank group， Huazhuo Granule group， rosiglitazone group， and model group. Each treatment group was given relevant medicine for gavage. Model group and blank control group were given normal saline for gavage. The general state， weight， and food ration of rats were observed. After ten-week medicine intervention， 10% chloral hydrate was used for anesthesia to detect the levels of FBG， OGTT （2 h PG）， and FINS. RT-PCR was used to detect the expressions of PI-3K and GLUT4 mRNA of rat skeletal muscle in all groups. Results Compared with model group， the levels of FBG， 2 h PG， and FINS decreased （P<0.05）；the expressions of PI-3K and GLUT4 mRNA of rat skeletal muscle increased significantly （P<0.05）. Conclusion Huazhuo Granule has the effects on increasing insulin sensitivity， which is related to activating insulin signal path of PI-3K and GLUT4 of skeletal muscle tissues.

Key words：Huazhuo Granule；type 2 diabetes；insulin resistance；PI-3K；GLUT4；rats

基金項目：甘肅省教育廳研究生導師科研項目計劃（1206-06）

通訊作者：李菲，E-mail：wowofiona@163.com

[8] Yini Jiang， Daobing Liu， Xiangying Kong， et al. Huogu I formula prevents steroid-induced osteonecrosis in rats by down- regulating PPARγ expression and activating Wnt/LRP5/β-catenin signaling[J]. Journal of Tranditional Chinese Medicine，2014， 34（3）：256-264.

（收稿日期：2014-12-13；編輯：華強）

2型糖尿病（T2DM）是一組由多原因引起的以慢性高血糖為特點的代謝性、系統性疾病，其病理機制是胰島素分泌不足/或胰島素抵抗（IR）。現代醫學認為，

IR是糖尿病發病的中心環節，不僅貫穿于T2DM的發生、發展的始末，同時也是導致T2DM各種合并癥的根源[1]。化濁顆粒是依據中醫濁毒理論組方的中藥復方制劑，前期研究表明，其可降低非酒精性脂肪肝大鼠的肝臟指數、減輕非酒精性脂肪肝大鼠的IR[2-3]。本實驗觀察化濁顆粒對T2DM大鼠骨骼肌組織胰島素信號通路中磷脂酰肌醇3激酶（PI-3K）、葡萄糖轉運蛋白4（GLUT4） mRNA表達的影響，進一步闡述其改善IR的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

雄性SPF級Wistar大鼠60只，4月齡，體質量（200±20）g，甘肅中醫學院實驗中心提供，合格證號SCXK（甘）2011-0001。

1.2 藥物

化濁顆粒（黃連、黃柏、雞內金、山楂、枳殼、丹參組成），甘肅中醫學院附屬醫院制劑科提供，批號20130423；羅格列酮片，太極集團重慶涪陵制藥廠有限公司，批號13010006。

1.3 主要試劑與儀器

10%水合氯醛，中國醫藥集團上海化學試劑公司；鏈脲佐菌素（STZ），美國Sigma公司；血清胰島素檢測試劑盒，上海麥約爾生物技術有限公司；SYBR Green，瑞士羅氏公司；Rnase-free水，北京百泰克生物科技有限公司；高純總RNA快速提取試劑盒、熒光實時定量PCR試劑盒及反轉錄試劑盒，中國寶生物工程（大連）有限公司；引物合成：大鼠PI-3K、GLUT4及β-actin基因特異性引物序列由中國寶生物工程（大連）有限公司設計并合成。穩豪倍優型血糖儀，強生（中國）醫療器材有限公司；酶聯免疫檢測儀，美國BD公司；C1000型PCR儀、CXF96型RT-熒光PCR儀，美國伯樂公司。

2 實驗方法

2.1 分組與造模

實驗大鼠普通飼料適應性飼養1周，禁食、禁水12 h后尾部針刺采血，測定空腹血糖（FBG），血糖正常大鼠入選。將60只大鼠按體質量標號后，隨機抽出12只為空白組，繼續普通飼料飼養；余下48只造模組均喂以高脂飼料 （豬油10%，膽固醇2%，膽酸鹽0.5%，蔗糖20%，普通飼料67.5%）[4-5]。SPF級實驗室喂養，自由飲水。4周后，造模組大鼠平均體質量增加20%，可確定建模成功；成模大鼠隔夜禁食12 h，期間不禁水，將STZ現溶于pH4.4檸檬酸-檸檬酸三納緩沖液中，按30 mg/kg腹腔注射 [6-7]，連續3 d，建立T2DM大鼠模型。禁食、不禁水12 h，尾靜脈采血，測大鼠尾靜脈FBG；50%葡萄糖溶液2.5 g/kg灌胃，行口服葡萄糖耐量試驗（OGTT），測餐后2 h血糖（2 h PG），取FBG≥11.0 mmol/L、2 h PG≥16.7 mmol/L大鼠歸入模型組[8]，未達標者均剔除。造模成功后，各組大鼠分籠，每籠3～4只，予因糖尿病大鼠飲水量增加，防止其水量不足，給予雙路喂水。將成模大鼠按隨機數字表法分為化濁顆粒組、羅格列酮組、模型組。除空白組給予普通飼料外，其余組均給予高脂飼料。

2.2 給藥

按人與大鼠的體表面積之比換算成人所用藥量：化濁顆粒組每日予化濁顆粒混懸液2.025 g/kg灌胃，羅格列酮組每日予羅格列酮混懸液0.36 mg/kg灌胃，灌胃體積1 mL/kg，空白組、模型組每日給予等量生理鹽水灌胃，每日1次，連續10周。

2.3 一般情況觀察

觀察大鼠的一般狀態、自主活動、精神狀態、體毛、色澤、飲水量、小便等。

2.4 體質量及攝食量測定

實驗前，電子天平測定大鼠體質量，開始予高脂飼料喂養后，每周于同一時間段稱重1次，觀察大鼠生長、體質量情況，依體質量變化隨時調整灌胃量，至灌胃10周，最后1次給藥后禁食12 h，再對每只大鼠進行稱重并記錄在攝食相似的情況下體質量的變化。

2.5 血糖測定

實驗前全部大鼠隔夜禁食、禁水12 h后，尾部取血，測血糖1次。實驗組予高脂飼料后，每周同一時間測大鼠血糖1次，直至灌胃結束。記錄高脂飲食及藥物灌胃后，各組大鼠血糖變化情況。

2.6 標本采集和處理

藥物干預10周后，最后1次灌胃并禁食12 h后稱重，檢測大鼠尾靜脈FBG、OGTT 2 h PG，OGTT結束后，所有大鼠均禁食12 h，10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，取血，測血清空腹胰島素（FINS）。并任取一側后肢骨骼肌，裝入凍存管，迅速凍存于液氮中，24 h后置于-80 ℃低溫冰箱保存，備用。

2.7 RT-PCR檢測大鼠骨骼肌組織磷脂酰肌醇3激酶、葡萄糖轉運蛋白4基因表達

2.7.1 骨骼肌總RNA的提取 取超低溫凍結骨骼肌組織約5 mg，加入200 ?L Trizol，剪碎組織，再加約1000 ?L Trizol，加入液氮，充分勻漿，靜置后離心，加入氯仿，吸取上清液，將其移入新的EP管中，加入氯仿約240 ?L，冰上靜置5 min， 4 ℃、12 000 r/min離心15 min；吸取無色上清液（含RNA）約400 ?L，移至新的無RNase EP管中，加入600 ?L異丙醇，充分混勻，冰上靜置10 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入75%乙醇1 mL，上下顛倒充分洗管壁，棄上清液，室溫下干燥沉淀約5 min。最后向EP管中加入50 ?L RNase-free水溶解，即為提取的總RNA液體，置于-80 ℃冰箱存儲，備用。

2.7.2 總RNA濃度及純度測定 用超微量分光光度計檢測并確定總RNA的純度與濃度，用A260/A280比值來判斷RNA純度，A（μg/mL）=A260×B×40 μg/mL。（A為總RNA濃度，B為稀釋的倍數）取2 μL用于RNA濃度及純度鑒定，100 μL Rnase Free dH2O調零，2 μL總RNA加入98 μLRnase Free dH2O中，分別在260 nm（RNA）和280 nm（PRO）波長處測OD值，用兩者比值衡量樣本純度，所提取樣本純度應當在1.8～2.0之間。

2.7.3 總RNA反轉錄 反應體系為20 ?L，總RNA量為100 ng，建立反轉錄反應體系。試劑確定為5×PrimeScript RT Master Mix、總RNA、Rnase Free dH2O，加入量分別為4、4、12 ?L，反轉錄反應條件為37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，冷卻至4 ℃。然后混勻并離心，進行反轉錄反應為cDNA。

2.7.4 RT-PCR檢測各組目標基因表達水平 取反轉錄完成的cDNA，專用SYBR Green熒光染料， RNase-free滅菌水和目的基因引物，引物序列如下：β-actin上游引物5'-AATTACTCCCTCTCCTA-3'，下游引物5'-ACTCATCTACTCCTCTTCT-3'；PI-3K上游引物5'-ACTCCTAAGCCATTAAA-3'，下游引物5'-ATCCAATA CTTTA-3；GLUT4上游引物5'-TTGCAGTGCCTGAGTC TTCTT-3'，下游引物5'-ATCACTTTCTGTGGGGCGTT-3'。應用CFX96 RT-PCR擴增儀，其反應總體系為25 ?L，采用試劑SYBR熒光染料、Forward、Reverse、DNA、無RNA酶滅菌蒸餾水，按順序加入EP管中，用量分別為6.25、0.5、0.5、1、4.25 ?L，最終濃度SYBR熒光染料為1（對比濃度）、Forward為0.4 ?mol/L×1、Reverse為0.4 ?mol/L×1。低速離心機離心后，放入RT-PCR儀中進行擴增，40個循環完成后，出現對應的RT-PCR擴增曲線與溶解曲線，進行PCR半定量分析。

3 統計學方法

采用SPSS19.0統計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示，計量資料組間比較采用獨立樣本t檢驗，給藥前后比較采用配對t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 一般情況

空白組大鼠精神狀態良好，活動靈敏，其體表皮毛光滑，且有光澤，食欲正常，尿量未見明顯增減；模型組皮毛有發黃的趨勢、較粗糙，毛色失去光澤，喜臥少動，飲水量和尿量均增加；進入實驗后期，模型組大鼠精神最差，出現不同程度的萎靡，反應遲鈍，無力、呈躺臥狀態，皮毛粗糙明顯，毛色發黃。與模型組比較，化濁顆粒組、羅格列酮組均有不同程度的改善。

4.2 大鼠體質量變化

空白組大鼠體質量未見減輕，呈穩定持續上升狀態。模型組、化濁顆粒組、羅格列酮組實驗早期均有不同程度的體質量增加；第5周開始，STZ造模后，各組體質量開始下降；給藥10周后，羅格列酮組大鼠體質量與模型組比較增加，但化濁顆粒組大鼠體質量仍緩慢下降（P<0.05）。結果見表1。

表1 各組大鼠給藥前后體質量比較（—x±s，g）

組別 只數 給藥前 給藥后

空白組 12 253.5±25.50 418.9±18.90

模型組 12 247.7±22.83 320.8±18.12

化濁顆粒組 12 250.7±24.53 289.8±15.55#

羅格列酮組 12 248.6±19.85 368.1±17.29

注：與模型組比較，#P<0.05

4.3 化濁顆粒對大鼠空腹血糖的影響

各組大鼠灌胃治療10周后，模型組FBG較給藥前未見明顯差異，但化濁顆粒組及羅格列酮組FBG較給藥前明顯降低（P<0.05）；化濁顆粒組和羅格列酮組FBG與模型組比較均有降低（P<0.05）。結果見表2。

表2 各組大鼠給藥前后FBG水平比較（—x±s，mmol/L）

組別 只數 給藥前 給藥后

空白組 12 4.52±0.48 4.48±0.51

模型組 12 21.54±2.88 26.47±1.23

化濁顆粒組 12 22.68±3.42 13.36±1.01#★

羅格列酮組 12 22.45±3.67 12.67±0.87#★

注：與模型組比較，#P<0.05；與本組給藥前比較，★P<0.05（下同）

4.4 化濁顆粒對大鼠餐后2 h血糖的影響

各組大鼠給藥10周后，模型組OGTT 2 h PG與給藥前比較未見明顯差異，但化濁顆粒組及羅格列酮組OGTT 2 h PG與給藥前比較明顯降低（P<0.05）；給藥后，模型組OGTT 2 h PG高于空白組（P<0.05）；化濁顆粒組及羅格列酮組與模型組比較，OGTT 2 h PG水平均有所降低（P<0.05），羅格列酮組優于化濁顆粒組（P<0.05）。結果見表3。

表3 各組大鼠給藥前后OGTT 2 h PG水平比較（—x±s，mmol/L）

組別 只數 給藥前 給藥后

空白組 12 4.63±0.46 6.94±0.62

模型組 12 21.54±2.88 25.98±3.25

化濁顆粒組 12 22.68±3.42 16.51±1.09★#

羅格列酮組 12 22.45±3.67 12.85±0.67★#*

注：與化濁顆粒組比較，*P<0.05

4.5 化濁顆粒對大鼠空腹血清胰島素的影響

模型組、化濁顆粒組和羅格列酮組給藥前與空白組比較FINS水平較高；給藥10周后，化濁顆粒組、羅格列酮組與給藥前比較，血清FINS水平有所下降（P<0.05），給藥后與模型組比較也有下降（P<0.05）。結果見表4。

表4 各組大鼠給藥前后血清FINS水平比較（—x±s，mU/L）

組別 只數 給藥前 給藥后

空白組 12 15.51±1.89 15.82±1.62

模型組 12 25.62±2.81 25.40±2.26

化濁顆粒組 12 25.81±3.24 19.38±3.25★#

羅格列酮組 12 25.90±2.89 19.16±4.75★#

4.6 化濁顆粒對大鼠磷脂酰肌醇3激酶、葡萄糖轉運蛋白4基因表達的影響

化濁顆粒組和羅格列酮組骨骼肌組織PI-3K及GLUT4 mRNA表達與模型組比較有所增加（P<0.05），模型組較空白組PI-3K、GLUT4 mRNA表達水平呈低表達（P<0.05）。結果見表5。

表5 各組大鼠骨骼肌PI-3K和GLUT4 mRNA表達比較（—x±s，2-ΔΔCt）

組別 只數 PI-3K mRNA GLUT4 mRNA

空白組 12 1 1

模型組 12 0.96±0.06 0.62±0.07

化濁顆粒組 12 1.10±0.10# 0.77±0.12#

羅格列酮組 12 1.17±0.24# 0.97±0.10#

5 討論

IR是指胰島素執行其正常生物作用的效應不足，表現為外周組織尤其是肌肉、脂肪組織對葡萄糖的利用障礙。IR普遍存在于T2DM中，是T2DM的主要發病因素之一。

PI-3K途徑是胰島素信號轉導的主要通路之一。研究表明，胰島素刺激包括脂肪和骨骼肌在內的靶組織攝取利用葡萄糖是通過胰島素受體（InsR）/胰島素受體底物-1（IRS-1）/PI-3K/GLUT4等一系列信號轉導過程完成的[9]。在PI-3K途徑中，當胰島素與靶細胞表面InsR結合，InsR即發生磷酸化并激活內在的酪氨酸激酶，導致IRS-1等酪氨酸殘基磷酸化，并與PI-3K的p85調節亞單位結合，催化P110而激活PI-3K，活化的PI-3K可加速GLUT4從胞內易位至胞膜，調節肌細胞、脂肪細胞和肝細胞對葡萄糖的攝取利用。這一信號轉導過程的任何環節障礙均可引起IR。模型組大鼠FBG、2 h PG、FINS均升高，提示本實驗所用動物模型基本符合T2DM的特征和要求。藥物干預后，化濁顆粒能降低大鼠FBG、2 h PG及FINS水平，說明該藥能有效改善T2DM大鼠的糖耐量異常，提高胰島素的敏感性。化濁顆粒組與羅格列酮組骨骼肌組織PI-3K及GLUT4 mRNA表達水平均較模型組顯著增加（P<0.05）。模型組PI-3K及GLUT4 mRNA表達水平較空白組呈低表達（P<0.05）。提示化濁顆粒提高胰島素敏感性的作用，與激活骨骼肌組織胰島素信號傳導通路中PI-3K和GLUT4的mRNA表達有關。另外，PI-3K和GLUT4活性在胰島素信號轉導過程中也起著重要的作用，化濁顆粒是否也通過增加其活性來改善IR，還有待今后進一步研究。

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（收稿日期：2014-10-30）

（修回日期：2014-11-22；編輯：華強）