基于流式細胞術的芒果基因組C值測定

摘 要 以‘串芒、‘象牙22號芒和‘白象牙芒的嫩葉為材料，改進了細胞核提取緩沖液配方， 優化了芒果細胞核提取方法，以基因組C值已知的‘Zea mays L. CE-777為內標，首次建立了適合于芒果的流式細胞術基因組C值測定方法。結果表明：3個芒果品種的二倍體細胞核中DNA含量分別為0.885 821 7、0.884 004 5、0.884 852 5 pg，基因組C值分別為0.433 166 8×109、0.432 278 2×109、0.432 692 9×109 bp；不同芒果品種間的基因組C值無顯著差異，但與同科其他種屬物種相比差異明顯。本研究可為芒果的基因組學研究、細胞生物學研究和種質資源研究提供重要依據。

關鍵詞 芒果；流式細胞術；基因組C值

中圖分類號 S667.7 文獻標識碼 A

Estimation of Genomic C Value of Mangifera indica L.

by Flow Cytometry

LIU Jin， KONG Guanghong， LI Kaixiong， NI Shubang

Yunnan Institute of Tropical Crops， Jinghong，Yunnan 666100，China

Abstract In order to establish the flow cytometry（FCM） method for estimation of mango genomic C value， young leaves of mango cultivar‘Chuanmang，‘Xiangya 22and‘White Xiangyawere used as the materials，based on the improved isolation method and the DNA reference standards from Zea mays L. CE-777. The results showed that the DNA content of diploid mango cultivar ‘Chuanmang，‘Xiangya 22and ‘White Xiangyawas 0.885 821 7 pg，0.884 004 5 pg and 0.884 852 5 pg， respectively，the genomic C value of the three mango cultivars was 0.433 166 8×109 bp，0.432 278 2×109 bp and 0.432 692 9×109 bp， respectively. There was no significant difference in the genomic C value among the three mango cultivars， but there was great difference in that compared with other species in Anacardiaceae family. This study could provide an important reference for the genomic research，cell biology research and germplasm resources research of Mangifera indica L.

Key words Mangifera indica L.；Flow cytometry（FCM）；Genomic C value

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.09.013

基因組大小（Genome Size）是指某種生物單倍體細胞核或配子中DNA的含量，通常以重量皮克（10-12 g/pg）或核苷酸堿基對數量（109 base pair/Gb）來表示，兩者的換算關系為：1 pg=0.978 Gb。由于基因組大小對于每種生物而言是一個常數（Constant），且具有該種的特征（Characteristic），而這2個詞都是以字母C開頭，因此也常用C值（C-value）來表述某種生物的基因組大小[1]。不同物種的基因組大小存在很大差異，在被子植物中，目前已知的基因組大小差異可達2 000倍左右[2]。基因組大小既與植物的生物學性狀存在著較強的相關性[3-4]，又與物種的進化位置有一定的關系[5-6]，因此已成為近年來的研究熱點之一。測定植物基因組大小的傳統方法有孚爾根微顯影法[7]（Feulgen microdensitometry）和化學分析法，流式細胞術（Flow cytometry，FCM）是近年發展起來的新技術，因操作簡單、結果準確，其在植物基因組大小預測[8-9]、細胞周期研究[10]、倍性鑒定[11-12]等領域的使用越來越廣泛。截至目前，國內外研究者已測定了8 510種植物的基因組C值[2]，但相對于共約40萬種的植物種類，已被測定基因組C值的僅是其中一小部分。

芒果（Mangifera indica L.）屬于漆樹科（Anacard

iaceae）杧果屬（Mangifera）的高大喬木，也是重要的熱帶和亞熱帶水果之一，享有“熱帶果王”的美譽，已有幾千年的栽培歷史，主要分布在熱帶、亞熱帶國家和地區，中國芒果主要分布在廣東、廣西、海南、云南、福建等省區[13]。前人的研究表明，盡管芒果是高度雜合體，但目前發現的芒果種質均為二倍體，染色體數目為2n=40，尚未發現有其他倍性的個體[14-15]。由于芒果葉片中含有多種次生代謝物，在細胞核提取和染色過程中存在諸多困難，僅Arumuganathan等[16]于1991年在其研究中提出芒果的基因組大小約為4.39×108 bp，但關于芒果基因組C值流式細胞術測定方法及不同芒果品種基因組C值的研究尚未見相關報道。本研究擬在前期研究的基礎上，優化芒果細胞核提取方法和步驟，改進細胞核提取緩沖液配方，首次建立了適用于芒果的流式細胞術基因組C值測定方法，并對3個芒果品種的基因組C值進行測定，為芒果的基因組學研究、細胞生物學研究和種質資源研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 待測樣品與內標材料 試驗于2014年在云南省熱帶作物科學研究所熱帶果樹研究中心細胞生物學實驗室進行。芒果品種‘串芒、‘象牙22號芒、‘白象牙芒的嫩葉采自云南省熱帶作物科學研究所芒果試驗地；內標材料Zea mays L. CE-777由捷克共和國實驗植物學研究所（奧洛摩茨）Jaroslav Dolezel惠贈。

1.1.2 儀器與試劑 流式細胞儀型號為BD Accuri C6，熒光染料、尼龍濾膜、鞘液等試劑及耗材分別購自廣州吉泰生物科技有限公司和BD醫療器械上海有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞核提取液配制 為找出測定芒果基因組大小的最佳流式細胞術方法，先后嘗試了目前使用范圍較廣的LB01、Tris-MgCl2、Galbraiths、mG、GPB、WPB、OTTO等多種細胞核提取方法，均未獲得成功，OTTO法主要表現為碎片峰過大，而其他方法無法檢測到樣本峰。因此，在Friedrich[17]和柳覲等[18]方法的基礎上對OTTO法的細胞核提取液配方進行了調整，調整后的OTTOⅠ配方為0.1 mol/L檸檬酸+0.02 mol/L Tris+0.6% Tween 20+0.02 mol/L MOPS，OTTOⅡ配方為0.5 mol/L十二水磷酸氫二鈉，將二者分別溶解并用0.22 μm濾膜過濾，OTTOⅠ保存在4 ℃，OTTOⅡ于室溫保存。

1.2.2 細胞核提取和染色 取長度在3 cm以內的芒果幼葉，剪取1 cm2立即投入盛有1 mL已預冷的OTTOⅠ和0.5 mL OTTOⅡ的塑料培養皿中；用一次性刀片快速切碎后用33 μm的尼龍膜過濾至1.5 mL的EP管中，確保切碎及過濾總耗時不超過45 s，在4 ℃、600 r/min下離心5 min后將上清液吸出丟棄；再加入1 mL已預冷的OTTOⅠ，將EP管緩慢顛倒3次混勻，然后再次于4 ℃、600 r/min下離心5 min，將上清吸出至EP管內殘余200 μL為止；再依次加入800 μL OTTOⅡ溶液、2.5 μL 10 mg/mL的RNase和30 μL 2 mg/mL的PI，將EP管緩慢顛倒3次混勻，避光放入4 ℃的冰箱種孵育5 min。若一批制備的樣品較多，在將孵育后的細胞核懸液染色后上機測試前可在4 ℃放置2 h，超過2 h熒光信號會明顯衰減且雜質峰較多，需重新制樣。

1.2.3 流式細胞術檢測 將制備好的‘串芒、‘象牙22號芒、‘白象牙芒和‘Zea mays L. CE-777細胞核懸浮液分別上機測試，初步確定其在585 nm（FL2）下細胞核的熒光強度。分別制備‘串芒﹢‘Zea mays L. CE-777、‘象牙22號芒﹢‘Zea mays L. CE-777和‘白象牙芒﹢‘Zea mays L. CE-777的細胞核混合懸液各18份， 測定混合懸液中的各樣本峰在585 nm （FL2）下細胞核的熒光強度，每樣品至少收集20 000個細胞核。

1.3 數據分析

1.3.1 基因組C值換算 在流式細胞術測定中，因PI是非特異性熒光染料，能均勻地插入雙核苷酸的堿基對中，細胞核中的DNA含量與結合在其上的PI熒光染料數量成正比，而PI染料的數量直接表現為熒光強度的大小，即細胞核DNA含量（基因組C值）與熒光強度成正比。計算方法為：待測樣品基因組C值=內標樣品基因組C值×（待測樣品熒光強度/內標樣品熒光強度）[18]。

1.3.2 數據收集及分析 運用CFlow Plus 1.0.264.15軟件進行數據收集，用Microsoft Excel 2003和SPSS16.0進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 芒果樣品與內標樣品熒光強度范圍的確定

將制備好的‘串芒、‘象牙22號芒、‘白象牙芒和‘Zea mays L. CE-777細胞核懸浮液分別上機測試，初步確定3個待測芒果品種與內標的熒光強度范圍，為下一步內標混合樣測試提供參考。以‘串芒為例（圖1-A），其和內標‘Zea mays L. CE-777（圖1-B）的細胞核在585 nm（FL2）下的熒光強度分別是236 207和1 340 517，內標的熒光強度約為待測芒果樣本的5.68倍，而熒光強度則表現為流式細胞術檢測圖中峰的位置，由此可確定芒果與內標的混合樣品在流式細胞術檢測圖中峰的位置無重疊，且區分度良好。在后續的內標混合樣流式細胞術檢測圖中，代表芒果細胞核的峰應位于流式細胞術檢測圖的左側，而代表內標Zea mays L. CE-777的峰應位于其右側。

2.2 芒果基因組C值的確定

分別將‘串芒﹢‘Zea mays L. CE-777‘、‘象牙22號芒﹢‘Zea mays L. CE-777和‘白象牙芒﹢‘Zea mays L. CE-777的細胞核混合懸液各18份上機測試，測試結果如圖2所示，每個芒果品種分別以其中1份樣品為例。由2.1的測試結果可知，在圖2中，左側的峰為待測芒果細胞核，右側的峰為內標‘Zea mays L. CE-777細胞核，2個峰在橫軸的位置代表各自細胞核的熒光強度。因細胞核DNA含量（基因組C值）與熒光強度成正比，而內標的基因組C值是已知的，因此可根據待測樣品與內標熒光強度的比例來計算待測芒果樣本的基因組C值。

Dolezel等[8]研究結果表明，內標‘Zea mays L. CE-777為二倍體，其細胞核DNA含量為2C=5.43 pg。從表1中3個芒果品種各18份內標混合樣的測試結果可以看出，‘串芒、‘象牙22號芒、‘白象牙芒的二倍體細胞核中DNA含量為0.885 821 7、0.884 004 5、0.884 852 5 pg，對應的單倍體細胞核DNA含量則分別為為0.442 910 9、0.442 002 3 、0.442 426 3 pg。按1 pg DNA=0.978×109 bp計算，‘串芒、‘象牙22號芒、‘白象牙芒的基因組C值為0.433 166 8×109 、0.432 278 2×109、0.432 692 9×109 bp。利用t檢驗對3個芒果品種的測試結果進行了比較，發現其基因組大小無顯著性差異，說明基因組大小在同一物種內是一個相對恒定的參數。

2.3 與近緣物種基因組C值的比較

芒果屬于漆樹科植物。漆樹科包含66個屬500余個種，但目前已被測定基因組大小的僅有7個種（表2），其中基因組C值最小的是芒果（0.44 pg），最大的是觀賞樹種Cotinus coggygria Scop.（黃櫨）（9.35 pg），說明即便是歸屬于同一科，不同種屬物種間基因組C值也存在較大變異，其變異原因需要進一步的進化生物學證據來闡明。

3 討論與結論

基因組大小測定的傳統方法是化學分析法和Feulgen染色法，化學分析法由于受細胞周期的影響，即處于不同周期的細胞其DNA含量不一致，測定結果也會出現相應的偏差[22]；Feulgen染色法相對精確，但操作過程過于繁瑣且需要較為熟練的操作技能。與傳統方法相比，流式細胞術測定法從制樣到上機獲取數據僅需十幾分鐘，且結果準確、重現性高。但由于不同物種的葉片結構和次生代謝物組成均不相同，與其對應的細胞核提取液和提取方法也有所不同，可見細胞核提取是流式細胞術的關鍵步驟。在本研究中，筆者先后嘗試了目前使用范圍較廣的LB01、Tris-MgCl2、Galbraiths、mG、GPB、WPB、OTTO等多種細胞核提取方法，均未獲得成功。僅OTTO法可偶爾看到樣本峰，但重現性差，且受細胞碎片、次生代謝物等干擾，無法實現精確定量。因此，筆者在柳覲等[18]研究的基礎上，再次改進了細胞核提取緩沖液配方，優化了芒果細胞核提取方法和步驟，首次建立了一種適合于芒果的流式細胞術基因組C值測定方法，并取得了良好的效果。

內標樣品的選擇是流式細胞術測定結果可靠的關鍵因素。本研究選用了Dolezel等[8]推薦的Zea mays L. CE-777作為對照樣品，且通過試驗證明，該對照樣品與待測芒果樣品的流式細胞術檢測峰區分度良好、無重疊，可確保試驗結果的準確性，因此，本結果具有較高的可靠性。同時，本研究與Arumuganathan等[16]的測定結果也相對一致，Arumuganathan等[16]認為芒果的基因組大小約為0.439×109 bp，造成測定結果存在細微差別的原因可能是所用的測試方法、內標樣品和供試芒果品種均不相同。本研究同時測定了‘串芒、‘象牙22號芒、‘白象牙芒3個芒果品種的基因組C值，發現3個品種間無顯著差異，說明基因組大小在同一物種內是一個相對恒定的參數。本研究發現，芒果與其他已知的漆樹科物種基因組C值差異較大，這可能與不同物種在進化過程中為適應其生存環境所經歷的自然突變、多倍化等進化過程有關。

基因組C值是物種最重要的遺傳參數之一，芒果作為中國重要的熱帶水果，其不同品種的基因組C值在國內外尚未見報道，本研究測定的不同品種基因組C值對芒果的起源進化研究和基因組學研究具有重要意義。此外，運用本研究建立的方法可以實現其他芒果品種或杧果屬不同物種基因組C值的快速準確測定，該方法亦可廣泛用于芒果的種質資源評價、倍性鑒定和突變體篩選等。

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