醌氧化還原酶2下調對大鼠主動脈平滑肌細胞線粒體膜電位的影響

蔡靜波 季鵬 尹紅麗 王嵐 郭紅梅

醌氧化還原酶2下調對大鼠主動脈平滑肌細胞線粒體膜電位的影響

蔡靜波 季鵬 尹紅麗 王嵐 郭紅梅

目的 研究醌氧化還原酶2(NQO2)下調對大鼠主動脈平滑肌細胞(RASMCs)線粒體膜電位的影響。 方法 將RASMCs分為3組:野生型組、陰性對照組和NQO2下調組。利用RNA干擾技術下調體外培養的RASMCs中 NQO2, 采用5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)滲入法檢測細胞增殖,用陽離子染料JC-1標記RASMCs線粒體內膜并檢測線粒體膜電位,試劑盒法檢測總超氧化物歧化酶(SOD)活性和細胞色素C水平。 結果 在野生型組、陰性對照組和NQO2下調組中,BrdU陽性細胞比率分別為(18.94±1.43)%,(18.29±0.92)%和(9.21±1.42)%,NQO2下調組的細胞增殖明顯被抑制(P<0.01); 3組細胞經JC-1標記后紅色/綠色熒光比值分別為15.48±0.41,15.96±0.52和13.58±0.12,NQO2下調組細胞線粒體膜電位明顯下降(P<0.01)。細胞色素C水平在3組細胞中分別為(9.62±0.29) ng/L,(9.36±0.07) ng/L和(15.83±0.83) ng/L,NQO2下調組明顯升高(P<0.01)。 結論 NQO2的下調可降低RASMCs線粒體膜電位,致細胞色素C釋放增加,抑制細胞增殖,誘導細胞凋亡,發揮抗動脈粥樣硬化作用。

線粒體膜電位; 大鼠主動脈平滑肌細胞; 醌氧化還原酶2; RNA干擾; 凋亡

動脈粥樣硬化是公認的心腦血管疾病的病理生理基礎,而后者仍然是目前我國國民主要的致死、致殘原因,造成極大的社會經濟損失[1]。現有研究證實線粒體功能異常可引起內皮功能障礙、血管平滑肌細胞增殖、巨噬細胞凋亡,從而導致動脈粥樣硬化的發生、發展及粥樣斑塊的破裂,誘發臨床事件[2]。

我們的前期研究發現采用小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)技術下調大鼠主動脈平滑肌細胞(RVSMCs)中的一種黃素蛋白——醌氧化還原酶2(quinone reductase 2, NQO2)的表達,可降低細胞內氧自由基(reactive oxygen species, ROS)的水平,阻抑細胞因子ERK1/2的磷酸化,從而抑制細胞的增殖[3],但這一過程是否有線粒體的參與尚不十分清楚。本研究通過探討下調NQO2基因對RVSMCs線粒體膜電位及其氧化還原功能的影響,從而為在亞細胞水平上防治動脈粥樣硬化性疾病提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 RASMCs購自齊氏生物科技公司;DMEM培養基、胎牛血清、D-Hank’s液、胰蛋白酶消化液購自Gibco公司;50 ml細胞培養瓶、6孔細胞培養板為corning公司產品;5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)檢測試劑盒、ATP檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒、細胞色素C檢測試劑盒及JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒均購自南京凱基生物科技公司;倒置熒光顯微鏡為Nikon公司產品。

1.2 大鼠主動脈RASMCs的培養與鑒定 RASMCs原代細胞貼壁生長于含20%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養基中,置于5%CO2、37 ℃培養箱中培養,每4 d換液1次。待細胞長至80%～90%融合時用0.125%胰蛋白酶消化液傳代培養,第3～8代細胞用于實驗。RASMCs呈梭形,具有“峰-谷樣”的生長方式。

1.3 RNA干擾慢病毒載體感染RASMCs及實驗分組 根據前期研究向上海吉凱基因化學技術有限公司定制針對大鼠NQO2 mRNA的RNA干擾慢病毒載體(Psc-NQO2)及陰性對照載體(Psc-NC)[4]。RASMCs以1×105個/孔的密度接種于六孔板中,24 h后每孔加入病毒液(滴度為5×108TU/ml)10 μl,孵育12～24 h后熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光的表達時,更換新鮮培養液培養72 h進行后續實驗。實驗分為3組,野生型即正常的RASMCs,陰性對照組即感染Psc-NC的RASMCs,NQO2下調組即感染Psc-NQO2的RASMCs。

1.4 Western blotting檢測NQO2 各組細胞加預冷的細胞裂解液200 μl冰浴30 min,4 ℃、13 000 g離心10 min,取上清測定蛋白質濃度。樣品經蛋白質電泳后轉至PVDF膜。一抗為兔抗鼠NQO2(1∶400)和兔抗鼠β-actin(1∶1000),二抗為辣根過氧化物酶標記的鼠抗兔IgG,采用化學發光法檢測。

1.5 JC-1法檢測線粒體膜電位 JC-1是一種具有線粒體膜電位依賴性聚集特性的陽離子染料。線粒體膜電位未降低或降低時,JC-1分別發射紅色和綠色檢測光,因此可用紅色/綠色熒光比值表示線粒體膜電位的降低。棄去舊培養液,用無血清培養基稀釋的JC-1溶液(終濃度為10 mg/L)對細胞進行染色,37 ℃孵育30 min后棄去染料,用GENios Pro reader (Tecan公司,瑞士)進行檢測,以紅色/綠色熒光比值表示線粒體膜電位的下降情況。

1.6 BrdU檢測細胞凋亡 BrdU作為一種胸腺嘧啶核苷的類似物,可在細胞增殖過程中參與核酸的合成,因此檢測BrdU的分布可判斷細胞增殖的情況。干預后的細胞在終止培養前用BrdU(終濃度為30 μg/L)于37 ℃孵育40 min,PBS洗滌細胞3次,甲醇/醋酸固定10 min,依次加兔抗大鼠BrdU單抗(工作濃度1∶50)和羊抗兔IgG(1∶200),用ABC法檢測,在顯微鏡下隨機計數10個高倍視野中細胞總數及BrdU陽性細胞數。

1.7 SOD活性及細胞色素C檢測 均按照試劑盒說明書操作,采用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD活力,采用雙抗體夾心 ABC-ELISA法測定細胞色素C水平。

2 結果

2.1 RNA干擾降低RASMCs中NQO2水平 經western blotting檢測,感染Psc-NQO2 72 h后的RASMCs胞漿內NQO2含量較野生型RASMCs降低約77.8%(0.222∶1),而陰性對照組與野生型組比較,細胞內NQO2水平無明顯改變(0.923∶1)。見圖1。

注:1為野生型組,2為陰性對照組,3為NQO2下調組圖1 Western blotting檢測RASMCs中NQO2水平

2.2 NQO2下調對RASMCs增殖的影響 野生型和陰性對照組RASMCs中BrdU陽性細胞比率分別為(18.94±1.43)%和(18.29±0.92)%,而NQO2下調組RASMCs中BrdU陽性細胞比率為(9.21±1.42)%,明顯低于前2組(P<0.01)。所以,NQO2下調可明顯抑制RASMCs增殖。見圖2。

圖2 NQO2下調對RASMCs增殖的影響(×100)

2.3 NQO2下調對RASMCs線粒體膜電位的影響 NQO2下調組的紅色/綠色熒光比值為13.58±0.12,明顯低于野生型的15.48±0.41和陰性對照組的15.96±0.52(P<0.01)。結果顯示NQO2下調可使RASMCs線粒體膜電位下降。

2.4 NQO2下調對RASMCs總SOD活性及細胞色素C的影響 NQO2下調組的總SOD活性較野生型和陰性對照組升高,但差異無統計學意義(P分別為0.224和0.261)。而NQO2下調組的細胞色素C水平則明顯高于野生型組和陰性對照組(P<0.01)。見表1。

組別總SOD活性(U/ml)細胞色素C(ng/L)野生型組928.30±53.259.62±0.29陰性對照組933.10±50.429.36±0.07NQO2下調組984.67±49.1215.83±0.83**

注:與野生型組和陰性對照組比較,**P<0.01

3 討論

動脈粥樣硬化目前被公認為是一種由多因素導致的炎癥反應性疾病[5]。殷亞昕等[6]報道辛伐他汀能通過降低動脈粥樣硬化大鼠高遷移率族蛋白1及其基因的表達,減輕炎癥反應,從而減少動脈粥樣硬化斑塊的形成。以往研究發現一種具有心血管保護作用的多酚類化合物白藜蘆醇可抑制血管平滑肌細胞的增殖，誘導其凋亡,從而實現抗動脈粥樣硬化的作用[7]，且這種多酚類化合物可與NQO2形成晶體結構從而降低胞漿內的NQO2水平。而利用RNA干擾技術構建的NQO2沉默的K562細胞同白藜蘆醇干預的K562細胞具有類似的抗甲萘醌毒性的特性[8-9],所以有學者認為白藜蘆醇是通過抑制NQO2實現心血管保護作用的,但其具體的細胞內作用途徑和機制尚不十分清楚。

近年來的研究顯示線粒體在動脈粥樣硬化進程中發揮重要作用。線粒體通過釋放過量的ROS導致其自身的功能障礙,從而誘導血管炎癥的發生,動脈粥樣硬化的發展[10]。線粒體在細胞凋亡過程中也發揮了關鍵作用,包括caspase激活物的釋放、電子轉移功能的喪失、線粒體跨膜電位的降低甚至消失,以及Bcl-2等蛋白的功能變化[11]。線粒體跨膜電位的下降是細胞凋亡級聯反應過程中較早發生的事件。因此,線粒體跨膜電位是常用的早期檢測細胞凋亡的指標之一。

本研究采用以往使用的RNA干擾慢病毒載體感染RASMCs的技術實現下調NQO2基因及蛋白的表達。結果顯示與野生型及陰性對照組相比,NQO2下調組RASMCs的增殖受到明顯抑制,線粒體膜電位顯著下降,同時伴有細胞色素C水平的明顯升高,提示NQO2基因的下調可影響線粒體的正常功能,誘導細胞凋亡的發生。

細胞內氧化應激也與細胞凋亡有著密切的關系。線粒體DNA突變可致線粒體呼吸衰竭而造成ROS的生成增加,ROS可進一步誘導線粒體DNA的突變,引起呼吸衰竭和脂質過氧化的形成,如此循環導致細胞損傷[12]。本研究發現NQO2基因下調組的總SOD活性較野生型和陰性對照組有升高,但無統計學差異,提示NQO2基因水平與RASMCs的氧化應激狀態有一定關系。

綜上所述,NQO2的下調可降低RASMCs線粒體膜電位,致細胞色素C釋放增加,從而誘導細胞凋亡,抑制細胞增殖。因此,白藜蘆醇抗動脈粥樣硬化的作用機制與下調血管平滑肌細胞的NQO2表達、影響線粒體功能、誘導細胞凋亡有關。

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Effects of down-regulation of quinone reductase 2 on mitochondrial membrane potential in rat aortic smooth muscle cells

CAIJing-bo,JIPeng,YINHong-li,WANGLan,GUOHong-mei.

DepartmentofCardiology,JiangsuProvinceGeriatricInstiture,Nanjing210024,China

Objective To investigate the effects of down-regulation of quinone reductase 2 (NQO2) on mitochondrial membrane potential in rat aortic smooth muscle cells (RASMCs). Methods RASMCs were divided into three groups, wild group, negative control group and NQO2down-regulated group. A lentiviral vector incorporating NQO2 short interference RNA of short hairpin was transduced into RASMCs. Cell proliferation was detected by bromodeoxyuridine (BrdU) assay. Flow cytometry was used to observe mitochondrial membrane potential. The contents of superoxide dismuta (SOD) and cytochrome C were detected by using kits. Results The proliferation of RASMCs was significantly inhibited by down-regulation of NQO2. Mitochondrial membrane potential in RASMCs with lower NQO2(13.58±0.12) was obviously lower than that in wild (15.48±0.41) and negative control cells (15.96±0.52) (P<0.01). Compared with wild (9.62±0.29 ng/L) and negative control cells (9.36±0.07 ng/L), RASMCs with suppressed NQO2 had significantly higher level of cytochrome C(15.83±0.83 ng/L) (P<0.01). Conclusions This study suggests that down-regulation of NQO2 signi-ficantly suppresses RASMCs proliferation and mitochondrial membrane potential, which may be the mechanism against atherosclerosis.

mitochondrial membrane potential; rat aortic smooth muscle cells; quinone reductase 2; RNA interference; apoptosis

江蘇省自然科學基金(BK2011841)

210024江蘇省南京市，江蘇省老年醫學研究所心內科

R 543.5

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2015.02.008

2014-05-05)