黃芪多糖對Caco-2細胞P-gp功能、表達的影響

陳琳瑤 阮 丹 王躍鑫 黃巧玲

黃芪多糖對Caco-2細胞P-gp功能、表達的影響

陳琳瑤 阮 丹 王躍鑫 黃巧玲

目的 觀察黃芪多糖（APS）對Caco-2細胞P糖蛋白（P-gp）功能、表達的影響。方法 采用MTT法考察藥物對細胞的毒性,確定藥物最大無毒濃度；流式細胞儀測定Caco-2細胞P-gp底物羅丹明-123（Rh-123）和抗體的熒光強度，評價APS對P-gp功能和表達的影響；建立Caco-2細胞單層模型，觀察APS對Rh-123跨膜轉運的影響。結果 細胞毒性實驗結果顯示，APS在0.1～100μg/mL濃度范圍內對Caco-2細胞無明顯毒性，細胞存活率＞90%；不同濃度的APS作用后，增加細胞內Rh-123的蓄積，對P-gp功能表現為抑制作用；中、高濃度50、100μg/mL的APS對P-gp表達有抑制作用［（26.72±2.43）、（23.97±2.08）比（30.10±1.28），P＜0.05］，其表達量分別降低11.23%和16.41%；高濃度APS 100μg/mL明顯抑制Rh-123的雙向跨膜轉運，對P-gp有抑制作用。結論黃芪多糖（APS）對P-gp的功能和表達有一定的抑制作用，且在高濃度尤為明顯，能顯著增加Rh-123在Caco-2細胞內的蓄積，并抑制其雙向跨膜轉運。

黃芪多糖；P糖蛋白；Caco-2細胞

中藥輔助治療腫瘤具有毒性小、安全有效、多靶點等優勢，其在逆轉腫瘤多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）[1-3]研究中受到越來越廣泛的關注。腫瘤多藥耐藥(MDR)是指腫瘤細胞對一種抗腫瘤藥物出現耐藥的同時，對其他結構不同作用靶位不同的抗腫瘤藥物也產生耐藥現象，其中P糖蛋白（P-gp）介導的多藥耐藥現象引起了廣泛的關注[4]。P-gp是一種能量依賴性膜蛋白，最初發現于腫瘤細胞，能將藥物逆濃度梯度轉運至胞外。在腫瘤治療中，P-gp能將化療藥物排出胞外，降低胞內藥物濃度，從而對治療造成不利影響。我院的復方氨肽口服液中主要中藥組分為黃芪提取液，主要有效成分為黃芪多糖（astragalus polysaccharide，APS），臨床上廣泛用于調節免疫功能。臨床試驗表明，復方氨肽口服液可通過體內免疫增強起到輔助抗癌作用[5-6]，然而該藥是否對P-gp存在抑制作用從而逆轉MDR現象則尚不明了。本實驗采用人結腸癌細胞細胞Caco-2細胞為模型，研究復方氨肽口服液主要成分黃芪多糖對Caco-2細胞P糖蛋白功能、表達的影響，為復方氨肽口服液在臨床上的合理應用提供理論依據。

1 實驗材料

1.1 藥物及試劑 Caco-2細胞（上海細胞庫），0.25%胰蛋白酶、DMEM培養基、0.01mol/L磷酸鹽緩沖鹽（PBS）（GIBCO，USA），胎牛血清（FBS）（杭州四季青生物材料有限公司），二甲基亞砜（DMSO）（Sigma，USA），100U/mL青-鏈霉素雙抗（碧云天生物技術研究所），黃芪多糖（astragalus polysaccharide，APS），購自陜西昂盛生物醫藥科技有限公司，純度：70%，鹽酸維拉帕米（Ver）（中國食品藥品檢定研究院，批號100223-200102），環孢素A（CsA）（Sigma，USA），羅丹明-123（Rh-123）（Sigma，USA）。

1.2 儀 器 恒溫CO2孵箱（Forma SeriesⅡ Water允acketed，HEPA filter，Thermo，美國），生物潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司），倒置相差顯微鏡（Nikon，TS100，日本）酶聯免疫檢測儀（Wellscan MK2，Thermo，美國），流式細胞儀（Becton-Dickinson FACScalibur，美國BD公司），12孔Transwell細胞培養板（Corning Costar，美國）。

2 實驗方法

2.1 Caco-2細胞培養及細胞毒性實驗 將對數生長期的Caco-2和ECV304細胞接種于25cm2的培養瓶中，加入5mL含10%FBS、100U/mL青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養基。在37℃、5%（體積分數）CO2的恒溫培養箱內進行培養，隔日換液。待細胞長至70%～90%時用0.25%胰酶消化并傳代。

將處于對數生長期的細胞以2×104個/mL的密度接種于96孔培養板，每孔200μL，上述條件培養24h，小心吸盡每孔培養液。設置空白調零孔、陰性對照孔及實驗孔，其中空白孔不接種細胞。空白調零孔和陰性對照孔每孔加入不含藥物的全培養基200μL，實驗孔中加入不同濃度的APS（0.1、10、20、50、100、200μg/mL）的系列工作液200μL，平行操作4份，按上述條件培養72h。每孔加入MTT液（5mg/ mL）20μL，37℃孵育4h。終止培養，小心吸棄上清液，每孔加150μL DMSO，振蕩搖勻使結晶物溶解，酶標儀進行檢測，以空白對照調零后，用酶聯免疫檢測儀測定490nm處的光密度值（OD），與陰性對照組比較計算細胞存活率，選擇存活率＞90%的最大藥物濃度。

細胞存活率100%=（實驗組平均OD值/陰性對照組平均OD值）×100%

2.2 黃芪多糖對Rh-123攝取的影響 精密稱取Rh-123，用去離子水溶解并稀釋，配成一定濃度的Rh-123溶液。將處于對數生長期的 Caco-2和ECV304細胞用胰酶消化，制成單個細胞，離心（1500r/min，5min），棄去上清液，PBS分散成細胞數為1×106的細胞懸液，均勻接種于EP管中。離心后棄上清液，按照實驗分組分別加入PBS配制的Ver陽性對照溶液（50μmol/L），APS系列工作液（0.1、10、20、50、100μg/mL）或PBS，于37℃、5%CO2培養60min，置冰上終止作用，4℃離心（2500r/min，15min），棄去上清液，冰冷的PBS洗2次。按實驗分組分別加入Rh-123溶液或PBS，37℃、5%CO2培養60min，置冰上終止作用，4℃離心棄去上清液，冰冷的PBS洗2次，4℃離心棄去上清液，細胞重懸于0.5mL PBS液中，用流式細胞儀測定10 000個細胞內熒光強度。2.3 黃芪多糖對P-gp表達的影響 用0.25%胰酶將處于對數生長期的Caco-2細胞消化分散成單細胞懸液，接種于25cm2培養瓶，加入含10%FBS、100U/mL青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養基。在37℃、5%CO2恒溫培養箱內進行培養，細胞貼壁后，按照實驗分組分別加入黃芪多糖系列工作液（實驗組，20、50、100μg/mL），環孢素溶液（陽性對照組，5μmol/L）或含10%FBS的DMEM培養基（陰性對照組）共培養72h。胰酶消化每瓶分裝至3個2mL的EP管，PBS洗2次，離心，棄上清液。按照實驗分組，加入PBS或抗體，4℃，孵育12h。孵育完畢后用PBS洗2次，離心，棄上清液，最后用0.5mLPBS重懸。激發波長為466nm，發射波長為535nm，測定10000個細胞，收集535nm處的熒光進行分析。

2.4 黃芪多糖對Rh-123跨膜轉運的影響 將密度為1×105個/mL的Caco-2單細胞懸液接種至12孔Transwell板，第一周隔日換液，后2周每日換液，待跨膜電阻值穩定在350Ω/cm2時用于轉運實驗。實驗分組見表1。

2.5 統計學方法 應用SPSS17.0軟件進行數據統計分析，計量資料以均值±標準差（±s） ，組間比較用方差分析或t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 黃芪多糖對Rh-123跨膜轉運影響實驗分組

3 結果

3.1 細胞增殖實驗 細胞毒性實驗結果顯示，APS在0.1～100μg/mL濃度范圍內對Caco-2細胞無明顯毒性，培養72h后細胞存活率＞90%，見表2。故選取此濃度范圍進行下一步的實驗研究。選取維拉帕米濃度50μmol/L為實驗濃度。由Caco-2細胞確定的非細胞毒性藥物濃度在陰性對照ECV304細胞上也沒有產生細胞毒性。

表2 不同藥物濃度下Caco-2細胞和ECV304細胞存活率（±s）

表2 不同藥物濃度下Caco-2細胞和ECV304細胞存活率（±s）

注：Ver：鹽酸維拉帕米；CsA：環孢素A；APS：黃芪多糖

孔數 細胞存活率（%）藥物APS（μg/mL）Ver（μmol/L）CsA（μmol/L）555555555濃度0.1 1 10 20 50 100 200 50 5 Caco-2 97.21±4.27 95.42±1.89 94.15±2.61 93.93±3.08 93.87±5.19 93.42±3.14 80.10±3.16 92.67±3.23 94.59±2.37 ECV304 97.52±3.12 95.17±4.89 96.23±2.83 95.31±3.01 94.78±2.90 91.97±3.43 83.76±2.77 95.99±2.95 94.26±2.41

3.2 黃芪多糖對Rh-123攝取的影響 實驗結果表明，藥物作用于Caco-2細胞后，APS各濃度組及陽性對照Ver組的熒光強度較空白對照組均有所增強，見表3。陽性對照組細胞內Rh-123的熒光強度顯著高于空白對照組（P＜0.05），增加了42.19%，與文獻報道相符，說明維拉帕米對Rh-123的外排有明顯抑制作用；不同濃度的APS對Rh-123外排的抑制率隨濃度的增加而增加，呈現濃度依賴性，該結果表明APS對P-gp的功能有一定的抑制作用。

表3 黃芪多糖對Caco-2細胞中Rh-123外排的影響（±s）

表3 黃芪多糖對Caco-2細胞中Rh-123外排的影響（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；Ver：鹽酸維拉帕米；APS：黃芪多糖

組別空白對照組APS（μg/mL）孔數Ver（μmol/L）44444444濃度PBS 0.1 1 10 20 50 100 50細胞內熒光強度118.33±5.45 120.14±3.16 121.36±2.19 127.33±2.01* 138.66±4.15* 145.75±3.75* 159.00±6.40* 168.25±2.33*熒光強度增加百分數（%）0 1.53 2.56 7.33* 17.18* 23.17* 34.37* 42.19*

3.3 黃芪多糖對P-gp表達的影響 研究結果表明，與Caco-2細胞共培養72h后，陽性對照組（CsA組）細胞內熒光強度顯著高于陰性對照組，說明環孢素可以明顯誘導上調Caco-2細胞P-gp表達水平，與文獻報道相符。HPS低濃度組（20μg/mL）細胞內的熒光強度與陰性對照組相比差異無統計學意義（P＞0.05），然而，中、高濃度組（50、100μg/mL）細胞內的熒光強度明顯低于陰性對照組（P＜0.05），其表達量分別降低11.23%和16.41%。以上結果表明低濃度的APS對P-gp表達基本沒有影響，隨著濃度的增加，對P-gp的表達有抑制作用，使其表達量減少，見表4。

表4 不同濃度黃芪多糖對Caco-2細胞P-gp表達的影響（±s）

表4 不同濃度黃芪多糖對Caco-2細胞P-gp表達的影響（±s）

注：與陰性對照組比較，*P＜0.05；CsA：環孢素A；APS：黃芪多糖

組別陰性對照組APS（μg/mL）孔數P-gp表達增加量（%）--CsA（μmol/L）44444濃度-20 50 100 5細胞內熒光強度30.10±1.28 29.25±3.01 26.72±2.43* 23.97±2.08* 79.85±5.15* -11.23* -16.41* 165.28*

3.4 黃芪多糖對Rh-123轉運的影響 在藥物干預3h后，Rh-123外排率有顯著變化。陽性對照維拉帕米組外排率為2.2%，較陰性對照組降低43.6%，表明其顯著抑制了Rh-123的跨膜轉運。APS高濃度組（100μg/mL）對Rh-123的外排率也有一定的抑制作用（P＜0.05），外排率為3.3%，較陰性對照組降低了15.4%；中、低濃度（20、50μg/mL）的APS則對Rh-123的外排轉運抑制作用不明顯（P＞0.05），見表5。

表5 黃芪多糖干預180min后Rh-123雙向表觀通透系數Papp和外排率

4 討論

黃芪屬補益類中藥，可提高機體免疫力，其主要生物活性成分黃芪多糖（APS）藥理作用廣泛，具有增強機體免疫功能、強心、抗病毒、抗腫瘤等作用。APS輔助抗癌作用已有較多報道[7-8]，認為APS通過免疫調節來發揮抗癌作用，而至于是否涉及對多藥耐藥（MDR）存在逆轉作用，則尚未完全明了。本研究發現，10～100μg/mL濃度范圍的APS能夠在1h內增加Caco-2細胞內的Rh-123的含量，抑制P-gp的功能，且呈現濃度依賴性。中、高濃度APS（50、100μg/ mL）不僅能抑制Rh-123的雙向跨膜轉運，長期使用還可抑制P-gp的表達。

上述結果表明，APS對Caco-2細胞P-gp功能和表達有抑制作用，屬于P-gp抑制劑，但抑制作用弱于維拉帕米。推測APS在與抗腫瘤藥物合用時，可抑制P-gp，增加細胞內化療藥物的濃度，從而逆轉多藥耐藥，提高療效。我院自制制劑復方氨肽口服液的主要中藥組分為黃芪提取液，其有效成分為黃芪多糖。本次研究及有關臨床研究[5]顯示，復方氨肽口服液可以在腫瘤患者的臨床治療中做進一步的推廣使用。

腫瘤多藥耐藥是造成腫瘤藥物治療失敗的重要原因之一，造成多藥耐藥的機制十分復雜，而其中對P-gp所介導的多藥耐藥研究也有著廣泛的研究。有研究表明，中藥輔助治療可通過競爭P-gp的結合位點、通過影響細胞膜的功能及通過影響ATP等方式，從而達到抑制P-gp的功能[9-12]。至于APS是通過哪種方式抑制P-gp的功能，有待進一步研究。

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（收稿：2015-03-20 修回：2015-05-11）

Effect of Astragalus Polysaccharide on the Function and Expression of P-glycoprotein in Caco-2 cells

CHEN Linyao,RUAN Dan,WANG Yuexin,HUANG Qiaoling. Pharmacy,Third People's Hospital of Hangzhou, Hangzhou(310009),China

Objective To investigate the effect of astragalus polysaccharide（APS）on the function and expression of p-glycoprotein（P-gp）in Caco-2 cells.Methods The cytotoxicity of different drug concentrations was measured by MTT assay,in order to confirm the maximum non-toxic concentration of the drug.Flow cytometry was used to detect the fluorescence of rhodamine 123 concentration and antibody concentration to evaluate the effect of APS on the function and expression of P-gp.The Caco-2 cell monolayer was built to evaluate the effect of APS on the bi-directional transports of Rh-123.Results The cell viability of Caco-2 cells was higher than 90%when the concentration of APS was between 0.1 and 100μg/mL with MTT.Compared with control groups,APS increased the cellular Rh-123 concentration,showing an inhibitory effect on P-gp function.When the cells treated with APS at 50 and 100μg/mL concentrations,respectively,the expression levels of P-gp in Caco-2 cells were decreased by 11.23%and 16.41%to 26.72±2.43 and 23.97±2.08 compared to that in control group（30.10±1.28,P＜0.05）.Rh-123 bi-directional transport experiment showed that the p-gp level was obviously inhibited after 72 h incubation with 100 μg/mL concentration APS.Conclusion APS can inhibit the function and expression of P-gp in Caco-2 cells,and can also reduce the bi-directional transport of Rh-123 when it is at a high concentration.

astragalus polysaccharide;p-glycoprotein;Caco-2 cells

浙江省中西醫結合學會科研項目（No.2013LYZD016）

杭州市第三人民醫院藥劑科（杭州 310009）

黃巧玲，Tel：（0571）86737209；E-mail：HQL6512@163.com