姜黃素對人支氣管上皮細胞MMP-9表達的影響

韋麗玲 朱美飛 黃立權 江榮林 王靈聰

·論 著·

姜黃素對人支氣管上皮細胞MMP-9表達的影響

韋麗玲 朱美飛 黃立權 江榮林 王靈聰

目的 觀察姜黃素（Cur）對人支氣管上皮細胞（HBECs）MMP-9表達的影響。方法 體外培養人支氣管上皮細胞，分為空白組、LPS組及LPS+姜黃素（Cur）組，其中LPS濃度為10μg/mL，姜黃素組在相同濃度LPS刺激下又各分為5、10、20、40和80μmol/L五個濃度組，作用4h后在顯微鏡下觀察細胞形態變化，采用實時熒光定量PCR觀察人支氣管上皮細胞MMP-9 mRNA表達量。結果 顯微鏡下觀察姜黃素（Cur）干預后HBECs細胞形態良好，無明顯損傷。RT-PCR結果顯示，空白組可見一定量MMP-9 mRNA表達（1.00124±0.12918）；與空白組比較，LPS組人支氣管上皮細胞MMP-9 mRNA表達量明顯增加［（1.75204±0.18837）比（1.00124±0.12918），P＜0.05］，80μmol/L Cur組亦可增加MMP-9 mRNA表達［（1.99646±0.39105）比（1.00124±0.12918），P＜0.05］。與LPS組比較，10μmol/L Cur組人支氣管上皮細胞MMP-9 mRNA表達量顯著下降［（0.67958±0.17142）比（1.75204±0.18837），P＜0.05］，5、20、40μmol/L Cur對支氣管上皮細胞MMP-9mRNA表達無明顯作用（P＞0.05）。結論 10μmol/L姜黃素（Cur）可降低人支氣管上皮細胞MMP-9mRNA表達。

人支氣管上皮細胞；姜黃素；MMP-9

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是一類鋅離子活性依賴、結構高度同源、主要作用于細胞外基質的蛋白水解酶大家族，MMP-9為成員之一，屬其亞型的明膠酶一族，又稱明膠酶B。它不僅可以降解變性膠原，還可降解多種細胞外基質成分，包括IV型膠原、纖維黏連蛋白、層黏連蛋白等。MMP-9可在多種細胞中表達，除了常見的炎癥細胞如巨噬細胞和中性粒細胞外，一些結構細胞在刺激下也可產生，如支氣管上皮細胞（human bronchialepithelial cells，HBECs）、成纖維細胞、平滑肌細胞及內皮細胞等。近年研究顯示，多種細胞因子可刺激支氣管上皮細胞分泌MMP-9并參與氣道重建[1-2]，而脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）作為致病菌的有效成分可以刺激細胞產生多種炎癥介質，促使MMP-9的表達。研究[3-4]表明，姜黃素（curcumin，Cur）可抑制炎癥因子的表達。本實驗擬體外培養觀察LPS作用下Cur對人支氣管上皮細胞（human bron-chial epithelial，HBECs）MMP-9表達的影響。

1 實驗材料

1.1 細 胞 人支氣管上皮細胞株BESA-2B，由中國科學院典型培養物保藏中心昆明細胞庫提供。

1.2 藥品及試劑 姜黃素（SIGMA，批號 BCBL 0424V）；LPS（SIGMA，批號 122M40010）；動物總RNA快速提取試劑盒（上海捷瑞生物工程有限公司）；逆轉錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA synthesis Kit（Thermo Scientific Fisher公司）；qPCR試劑盒SuperRealPreMix Plus（SYBR Green)（TIANGEN公司）。

1.3 儀 器 二氧化碳培養箱、3111型和微量加樣器（均為Thermo公司）；倒置熒光顯微鏡（江南公司）；臺式低速離心機（80-2型，上海醫療器械（集團）有限公司）；細胞培養瓶、細胞培養板（均為Corning公司）；超凈工作臺（蘇州凈化）；OD值測量儀器（Merinton SMA4000）；定量PCR儀（M允Mini Personal Thermal Cycler，配套使用的分析軟件為BIORAD CFX Manager）；相關耗材如Tip頭、EP管等（Thermal Scientific Fisher公司，均為無 RNase、DNase和無熱源的分子生物學耗材）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養和分組 復蘇BEAS-2B細胞，用LHC-8無血清培養基，37℃、5%CO2培養箱孵育培養，使用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗，0.125%Trypsin+ 0.01%EDTA消化細胞進行傳代培養并調整細胞狀態。待細胞傳代一定程度，取對數生長期細胞，0.125%Trypsin+0.01%EDTA消化離心，計數后，以2× 105/well鋪6孔板，37℃、5%CO2培養箱孵育培養。24h后，將細胞分為空白組、LPS（10μg/mL）組、同濃度LPS+Cur各組（5μmol/L Cur組，10μmol/L Cur組，20μmol/L Cur組，40μmol/L Cur組和80μmol/L Cur組），作用4h。取Cur干預4h后的細胞放在倒置顯微鏡下觀察其形態變化。

2.2 RT-PCR法檢測MMP-9mRNA表達 細胞處理完畢，用Trizol法按照動物總RNA快速提取試劑盒說明提取總RNA并反轉錄為cDNA，將其加入到PCR體系中進行擴增。擴增反應體系為：2×SuperRe alPreMix Plus，10μL；Forward primer，5μM：0.6μL；Reverse primer，5μM：0.6μL；cDNA模板（加dd H2O稀釋成7ng/μL∶8.8μL；總計20μL。MMP-9引物上游：5'-TTTGAGTCCGGTGGACGATG-3'，下游引物：5'-GCTCCTCAAAGACCGAGTCC-3'，產物大小為197bp。β-actin引物上游：5'-GACTTAGTTGCGTTACACCCTTTC-3'，下游引物：5'-GACTGCTGTCACCTTCACCGT-3'，產物大小為163bp。擴增條件：95.0°C，3min；95.0°C，10s；59.0°C，20s；72.0°C，30s。共51個循環。

2.3 統計學方法 應用SPSS17.0統計軟件進行數據處理，實驗數據以均數±標準差（±s） 表示，各組間均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 顯微鏡下細胞形態變化 人支氣管上皮細胞經Cur干預后，在顯微鏡下可觀察到多數細胞形態良好，細胞無明顯損傷，見圖1（封二）。

3.2 各組人支氣管上皮細胞MMP-9mRNA表達實時熒光定量PCR擴增結果顯示，空白組可見一定量MMP-9mRNA表達，與空白組比較，LPS組MMP-9 mRNA表達量明顯增加（P＜0.05），80μmol/L Cur組亦可增加MMP-9 mRNA表達（P＜0.05）。與LPS組比較，10μmol/L Cur組MMP-9mRNA表達量顯著下降（P＜0.05），5、20、40μmol/L的Cur對支氣管上皮細胞MMP-9mRNA表達無明顯作用（P＞0.05），見表1。基因擴增曲線見圖2（封二）。

表1 各組人支氣管上皮細胞MMP-9mRNA表達量比較（±s）

表1 各組人支氣管上皮細胞MMP-9mRNA表達量比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與LPS組比較，△P＜0.05；LPS：脂多糖；Cur：姜黃素

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4 討 論

近年國內外的研究顯示，支氣管上皮細胞在多種體內、外因素的作用下大量表達MMP-9。Hozumi等[1]發現TNF-α可誘導人支氣管上皮細胞分泌MMP-9，其信號傳導過程由NF-κB途徑介導；另一項研究亦發現TNF-α、刀豆素A及機械刺激人支氣管上皮細胞可導致MMP-9表達和分泌[5]。LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁的一種成分，可介導細胞表達分泌MMP-9。研究[6]表明，LPS是MMP-9強誘導劑，在mRNA及蛋白水平上誘導其高表達，且誘導作用與LPS的濃度和時間呈依賴性，Ma等[7]通過實時PCR及Westblot結果顯示，在肺損傷模型6h后的肺組織中，LPS組MMP-9mRNA和蛋白表達量較對照組顯著增加，明膠酶譜檢測MMP-9活性亦明顯提高。Cheng等[8]發現在H9c2心肌母細胞株中LPS通過ERK1/2信號通路能上調uPA、MMP-2、MMP-9的表達。LPS作為致病菌的主要致病成分，能激活多種細胞分泌諸如TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8等細胞因子，進而激活NF-κB等信號通路途徑引起MMP-9分泌釋放。目前已經證實，MMP-9基因啟動子上存在NF-κB、AP-1等核因子的結合位點，TNF-α、IL-1β、IL-6等細胞因子可通過這些核因子的激活而調節MMP-9的表達。本實驗中空白對照組支氣管上皮細胞有少量MMP-9 mRNA表達，經LPS刺激后，與空白組比較，MMP-9 mRNA表達量明顯上升（P＜0.05），說明人支氣管上皮細胞在經LPS刺激后，激活一系列細胞因子，這些細胞因子經過核因子-κB途徑調節細胞大量產生MMP-9。

姜黃素（curcumine）為姜黃的天然色素，目前已作為一種有多種功效的藥物而廣泛應用于臨床。中醫認為，姜黃具有行氣、活血散風和通絡止痛功效。近年研究證實姜黃素能抗氧化、抗感染、抗凝、降血脂、防動脈粥樣硬化和抑制腫瘤生長。張筠等[9]發現姜黃素能明顯降低TNF-α誘導的人臍靜脈內皮細胞MMP-9的表達，與Yu等[10]觀察姜黃素通過下調NF-κB抑制MMP-9表達阻礙TNF-α誘導人動脈平滑肌細胞移行的報道一致。而ERK1/2通路在信號傳遞中亦發揮作用，研究[8]發現，使用ERK1/2抑制劑后能減少MMP-9表達，并降低后者活性。我們前期研究[11]也發現姜黃素能降低APE大鼠肺ERK、PI3K、Akt水平，抑制其通道，從而減少TNF-α、IL-1β、IL-6等細胞因子的釋放，減輕肺組織損傷。本研究結果顯示，擴增曲線提示擴增多在20～40之間，符合要求；與LPS組比較，Cur各濃度組對人支氣管上皮細胞MMP-9 mRNA表達的抑制強度并不呈濃度依賴性，5、20、40μmol/L Cur組對LPS誘導下的支氣管上皮細胞作用不佳（P＞0.05），而10μmol/L Cur組作用最顯著，能明顯抑制支氣管上皮細胞MMP-9 mRNA表達（P＜0.05）。據此推測，10μmol/L Cur通過下調TNF-α等細胞因子的表達激活而抑制ERK1/2和核因子-κB的信號通路，減少支氣管上皮細胞MMP-9 mRNA表達，在顯微鏡下也能觀測到Cur干預后細胞形態良好，未見明顯損傷。而80μmol/L Cur組與空白組比較，Cur未見抑制作用，反而增加了MMP-9 mRNA表達量，提示大劑量Cur不僅不會提高療效，可能還會存在潛在的細胞毒風險，而產生相反的效果。

綜上所述，Cur對人支氣管上皮細胞MMP-9 mRNA表達有抑制作用，以濃度10μmol/L的Cur效果最佳，其作用機制可能與細胞因子釋放激活相應信號通路有關，有待進一步研究闡釋其過程。

［1］Hozumi A，Nishimura Y，Nishiuma T，et al.Induction of MMP-9 in normal human bronchial epithrlial cells by TNF-αvia NF-κB-mediated pathway［J］.Am允Physiol Lung Cell Mol Physiol，2001，281（6）：L1444-L1452.

［2］Urpo L，允effrey AW，Susan EW，et al.Interleukin-1βcauses pulmonary inflammation,emphysema，and airway remodeling in the adult murine lung［J］.Am允Respir Cell Mol Biol，2005，32（4）：311-318.

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［4］Zhe M,Chao Y,Qian D,et al.Curcumin inhibits LPS-induced inflammation in rat vascular smooth muscle cells in vitro via ROS-relative TLR4-MAPK/NF-κB pathways［J］.Acta Pharmacologica Sinica，2013，34（7）：901-911.

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［7］Ma B，Zhou PY，Ni W，et al.Inhibition of activin receptorlike kinase 5 induces matrix metallopeptidase 9 expression and aggravates lipopolysaccharide-induced pulmonary injury in mice［J］.European Review for Medical and Pharmacological Sciences，2013，17（8）：1051-1059.

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［10］Yu YM，Lin HC.Curcumin prevents human aortic smooth muscle cells migration by inhibiting of MMP-9 expression［允］.Nutrition Metabolism&Cardiovascular Diseases，2010，20（2）：125-132.

［11］王靈聰，張微，吳建濃，等.姜黃素對急性肺栓塞大鼠細胞外調節蛋白激酶、三磷酸肌醇激酶、蛋白激酶B的影響［J］.中醫雜志，2013，54（18）：1592-1595.

（收稿：2014-11-24 修回：2015-05-07）

Effects of Curcumin on the Expression of MMP-9 in Human Bronchial Epithelial Cells

WEI Liling,ZHU Meifei,HUANG Liquan,允IANG Ronglin,WANG Lingcong. ICU,First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310006),China

Objective To investigate the effect of curcumin（cur）on the expression of matrix metalloproteinase 9（MMP-9）in human bronchial epithelial cells（HBECs）.Methods HBECs was cultured in vitro and divided into blank group,LPS group and cur groups.LPS group was set at 10μg/mL and cur groups were set at 5 concentrations of 5,10,20,40,80μmol/L after the stimulation of the same LPS concentration.Morphological changes of HBECs were observed through a microscope after cur intervention and real-time quantitative PCR was performed to examine the dynamic expression of MMP-9 in HBECs after 4h.Results The morphology of cells were well maintained in absence of significant damage after cur intervention.Real-time PCR results showed that blank group produced a certain amount of MMP-9 mRNA expression（1.00124±0.12918）and that LPS group and cur group with 80μmol/L concentration had significantly increased expression of MMP-9 mRNA in HBECs（1.75204±0.18837 and 1.99646±0.39105 vs blank group,P＜0.05）.Compared with LPS group,cur group with 10μmol/L concentration had decreased MMP-9 mRNA exepression in cells（0.67958±0.17142,P＜0.05）,but other cur groups（5,20,and 40μmol/ L）had no marked effect on the expression of MMP-9 in HBECs（P＞0.05）.Conclusion Curcumin of 10μmol/L can lower the expression of MMP-9 mRNA in HBECs.

human bronchial epithelial cells;curcumin;MMP-9

浙江省衛生高層次創新人才培養工程項目資助，浙江省自然科學基金（No.Y207052，LY12H29005）

浙江中醫藥大學第一臨床醫學院ICU（杭州 310006）

王靈聰，E-mail：wlc501@139.com；Tel：（0571）86620356