巴馬小型豬T2DM模型胰島素抵抗及瘦素、抵抗素水平的變化

于健，鄒迪莎，葉瑤，周燕，胡璟，楊帆，黃漓莉，劉曉玲，莫如芬

(1桂林醫學院附屬醫院，廣西桂林541001;2桂林醫學院研究生院)

目前，2型糖尿病(T2DM)的確切發病機制仍未明確。研究發現，脂肪細胞因子瘦素、抵抗素等與T2DM、肥胖與高胰島素血癥、胰島素抵抗(IR)密切相關［1～3］。2013年5月 ～2014年5月，我們通過構建巴馬小型豬T2DM模型，觀察其血清瘦素、抵抗素水平變化，旨在探討巴馬小型豬T2DM模型IR及與血清瘦素、抵抗素水平的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物:健康雄性廣西巴馬小型豬10只，2～3個月齡，體質量10～20 kg。均給予常規飲水，每日投食3次，飼養條件為室溫18～25℃，每日光照約12 h，相對濕度50% ～80%，有持續空氣交換。小型豬適應性喂養1周后，隨機分為對照組、模型組各5只。對照組普通飼料喂養;模型組高脂高糖飼料喂養(高脂高糖飼料配方為:蔗糖37%、豬油10%、膽固醇2%、普通飼料51%)。喂養期為10個月，實驗過程中對動物的處理方法符合中華人民共和國科學技術部頒發的《關于善待實驗動物的指導性意見》。實驗藥品:瘦素、抵抗素試劑盒購自美國Phoenix Pharmaceutical公司;胰島素放射免疫分析試劑盒購自北京北方生物技術研究所;胰島素單克隆抗體購自福州邁新生物技術開發有限公司;豬油、蔗糖、普通飼料均購自桂林市漓源糧油飼料有限責任公司;蛋黃粉購自南通康德生物制品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 T2DM模型的構建 根據動物體質量稱取適量鏈脲佐菌素(STZ)溶于0.1 mol/L檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.2～4.5)中，濃度為10 g/L，禁食空腹注射STZ溶液。實驗至11個月初給予模型組小型豬腹腔注射STZ 100 mg/kg，1周后，重復上述劑量1次。對照組小型豬腹腔注射等劑量檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖液。成模標準參照1999年世界衛生組織糖尿病診斷標準:具有糖尿病典型癥狀(多尿、多飲、多食及消瘦)，且空腹血糖(FPG)≥7.0 mmol/L或隨機血糖≥11.1 mmol/L。如無糖尿病癥狀，則需空腹和餐后血糖同時達到上述標準時，才可診斷糖尿病。

1.2.2 FPG、胰島素(FINS)、瘦素、抵抗素水平檢測

禁食過夜的小型豬前腔靜脈抽血，FPG采用葡萄糖氧化酶法檢測;瘦素、抵抗素采用酶聯免疫分析法檢測;胰島素放射免疫分析試劑盒檢測FINS水平。胰島素抵抗指數(HOMA-IR)=FPG×FINS/22.5。

1.2.3 胰腺組織HE染色及胰島β細胞免疫組化染色 實驗結束時(12個月末)，將對禁食過夜的小型豬肌肉注射速眠新(0.2～0.25 mL/kg)，聯合10%水合氯醛(2 mL/kg)腹腔注射麻醉，股動脈放血處死，取胰腺組織，常規固定、脫水、石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察。并取胰腺組織石蠟切片，胰島素單克隆抗體作免疫組化染色(按試劑盒操作步驟進行)。

1.2.4 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件，計量資料以±s表示，數據行正態分布檢驗;組間計量資料比較采用t檢驗，瘦素、抵抗素水平變化及與HOMA-IR的關系采用Pearson相關分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般情況比較 對照組精神狀況良好，毛發光澤，生長良好。模型組均成模，成模小型豬毛發粗糙、無光澤，精神萎靡，并出現多尿、多飲、多食及體質量下降等糖尿病癥狀。高脂高糖飼料喂養10個月后，模型組體質量［(86.32±5.86)kg］較對照組［(41.54±4.54)kg］升高，差異有統計學意義(t=15.672，P ＜0.01)。

2.2 高脂高糖飲食對小型豬FPG、FINS及HOMAIR的影響 高脂高糖飼料喂養10個月后，模型組FBG、FINS及 HOMA-IR較對照組均升高(P＜0.01)。見圖1。

圖1 高脂高糖飲食對小型豬FPG、FINS及HOMA-IR的影響

2.3 STZ對小型豬FPG、FINS的影響 實驗11個月初模型組腹腔注射不同劑量STZ;實驗結束時(12月末)與對照組比較，模型組FPG水平升高，FINS水平降低(P均＜0.01)，且模型組FPG穩定維持在9.8～15.6 mmol/L水平。見圖2。

2.4 兩組胰腺組織HE染色結果比較 模型組鏡下可見胰島整體形態萎縮，邊緣不規整，細胞排列紊亂，胰島及胰島內細胞數目均減少，部分細胞核形狀不規則，胞質內呈空泡變性。對照組胰島呈圓形或橢圓形，邊緣規整，與腺體緊密結合在一起，胰島及胰島內細胞數目多，胞核清晰且胞質豐富，整個胰腺組織結構基本正常。

2.5 兩組胰島β細胞免疫組化染色結果比較 模型組每視野下(×200)可見散在數個胰島細胞團，細胞排列紊亂，高倍鏡(×400)下胰島β細胞團整體形態結構破壞，胞質內棕黃色顆粒明顯減少。對照組每視野下(×200)可見多個胰島細胞團，細胞排列整齊，高倍鏡(×400)下胰島β細胞團整體形態完整，占胰島細胞絕大部分，胞質內棕黃色顆粒著色深且含量豐富。

圖2 STZ注射不同時間點兩組FPG及FINS水平比較

2.6 T2DM小型豬瘦素、抵抗素水平變化及與HOMA-IR相關性分析 實驗結束時，模型組血清瘦素水平［(24.78±6.80)μg/L］較對照組［(13.68±6.04)μg/L］升高(t=2.729，P=0.026)。模型組血清抵抗素水平［(53.52±9.16)μg/L］較對照組［(38.95 ±10.39)μg/L］升高(t=0.351，P=0.047)。HOMA-IR與血清瘦素水平呈正相關(r=0.893，P=0.042)，與血清抵抗素水平呈正相關(r=0.933，P=0.020)。

3 討論

本實驗首先采用高糖高脂飼料喂養小型豬，結果發現模型組出現明顯肥胖，胰島素水平逐漸升高，并產生IR，表現T2DM的病理特征，與Torres-Rovira等［4］研究結果一致。為進一步誘導典型T2DM模型，實驗11個月初腹腔注射STZ，結果發現模型組在高糖高脂飲食基礎上聯合STZ注射可以成功構建T2DM模型，成模小型豬均表現出典型“三多一少”糖尿病癥狀，且FPG水平顯著上升，FINS水平下降。胰腺病理切片及免疫組化均提示，成模組胰島β細胞破壞嚴重，數目明顯減少。結果提示應用高脂高糖喂養聯合STZ注射可以成功構建小型豬T2DM模型，與既往研究結果一致［5］。

瘦素是由肥胖基因編碼、脂肪組織分泌的蛋白質類激素。瘦素通過降低食欲、提高能量代謝效率、增加能量消耗、減少脂肪儲存而減輕體質量;瘦素與脂肪代謝相關的疾病，如肥胖、T2DM、高脂血癥、高血壓、心腦血管病等密切相關，是聯系免疫系統和神經內分泌系統的重要橋梁。抵抗素也是一種由脂肪細胞分泌的多肽類激素，被認為是T2DM、肥胖、IR、糖尿病血管并發癥及其血脂異常的重要聯系因素。抵抗素引起IR的機制尚不明確，可能通過降低骨骼肌細胞、脂肪細胞、胰島β細胞胰島素敏感性，抑制肝臟糖代謝及增加FFA水平等誘導IR［6］。本研究結果表明，與對照組比較，模型組小型豬存在明顯IR，血清瘦素、抵抗素水平升高，且HOMA-IR與瘦素、抵抗素呈正相關，與其他研究一致［7］。

綜上所述，采用高脂高糖飼料聯合STZ可以成功誘導巴馬小型豬T2DM動物模型，模型組小型豬血清瘦素及抵抗素水平升高，且HOMA-IR與瘦素、抵抗素呈正相關。

［1］劉才華.2型糖尿病病人血清TNF-α、瘦素及抵抗素水平與心腦血管并發癥相關性［J］.青島大學醫學院學報，2014，50(2):136-138.

［2］石柯，張暢，段朝軍，等.高脂性肥胖小鼠脂肪細胞大小與其血清胰島素、瘦素水平相關性研究［J］.中國現代醫學雜志，2013，23(28):11-14.

［3］楊冰，顏海青，夏振雄.肥胖兒童血清抵抗素與胰島素抵抗的相關性［J］.檢驗醫學與臨床，2014，11(12):1694-1695.

［4］Torres-Rovira L，Astiz S，Caro A，et al.Diet-induced swine model with obesity/leptin resistance for the study of metabolic syndrome and type 2 diabetes［J］.Scientific World J，2012，5(2):1-8.

［5］肖國華，張素君，余堅，等.高糖高脂聯合低劑量STZ誘導版納微型豬2型糖尿病模型的建立［J］.中南醫學科學雜志，2012，40(4):351-356.

［6］張艷紅，楊偉，馮明.抵抗素與胰島素抵抗、肥胖及2型糖尿病的關系［J］.中國全科醫學，2010，13(36):4158-4160.

［7］黃映光，孫若飛，王昆華，等.糖尿病動物建模前后脂肪細胞因子水平變化［J］.昆明理工大學學報(自然科學版)，2013，38(1):77-79.