人工設計二硫鍵增強谷氨酰胺轉胺酶熱穩定性

劉中美， 杜 坤， 周哲敏

（江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122）

谷氨酰胺轉胺酶（Transglutaminase，TGase，EC 2.3.2.13）是一種能夠催化酰基轉移反應的酶。它可以催化谷氨酰胺殘基的γ-羧酰胺基與各種酰基受體發生反應，實現蛋白質分子內、分子間交聯，從而極大地改變蛋白質的性質[1]。TGase廣泛應用于食品行業、生物醫藥、組織工程、紡織和皮革處理等多個領域[2-3]。由于TGase的卓越催化功能而倍受越來越多的研究者的青睞，它被譽為 “21世紀超級粘合劑”。

對TGase的研究可以追溯到50年前，美國生物化學家Heinrich Waelsch在人腦和肝臟提取物中首次發現具有酰胺基轉移催化功能的TGase酶[3]。微生物來源的 TGases （Microbial TGase，MTG）是1989年日本味之素公司首次發現的，由土壤中分離出的茂原鏈霉菌（Streptomyces mobaraense）產生[4]。與其它來源的TGase相比，MTG具有非Ca2+依賴性、溫度和pH穩定性高等特點[5-6]。此外，MTG生產周期短、產量高、成本低，易于工業化生產。S.mobaraense來源的MTG一級氨基酸序列于1993年被測定[7]，由331個氨基酸組成，與動物來源的TGase相比，二者序列相似度低。S.mobaraense MTG的晶體結構于2002年被解析，二級結構屬于α+β型，含11個α-螺旋及8個β-折疊；催化活性基團Cys64、Asp255和His274均位于分子裂縫底部[8]。

目前，微生物來源的MTG已經實現了商品化（ActivaTM），ActivaTM中每克粉末中含有100個單位的酶活，但是其中只有體積分數1%的蛋白，體積分數99%的是麥芽糖糊精。麥芽糖糊精的作用是增強MTG的穩定性和使產品易于操作[9]，因為酶的熱穩定性越好，在應用過程中可耐受的操作溫度越高，反應速率越快，成本也就越低。德國馬丁路德大學的Pietzsch研究組利用隨機突變和飽和突變等技術，提高了S.mobaraense來源的MTG的熱穩定性。研究結果表明，影響MTG熱穩定性的突變點大都集中在MTG的N端區域[10]。

作者參考Pietzsch研究組的實驗結果，采用理性設計手段，通過分子生物學技術、結構分析軟件、分子模擬等手段對Streptomyces hygroscopicus來源的MTG進行分子改造。通過結構比對和序列分析，并借助二硫鍵預測軟件Disulfide by design，在MTG的N端區域引入二硫鍵，使MTG的熱穩定性得到提高，進一步促進其工業化應用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒 質粒pET22b-pro-MTG、E.coli BL21（DE3）和E.coli JM109為本實驗室保存。

1.1.2 試劑與儀器 N-carboxybenzoyl-L-glutaminyl-glycine （N-CBZ-Gln-GLy）、L-谷氨酸-γ-單羥胺酸購自Sigma公司；中性蛋白酶Dispase：購自Worthington公司，PCR引物：生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

紫外分光光度計（UV-1800）：上海美譜達有限公司產品；HiTrap Q HP和HiTrap SP HP：GE公司產品；AKTA avant：GE 公司產品；Millipore 超濾離心管 Ultra-15 3K，默克公司產品。

1.1.3 主要培養基 LB培養基：10 g/L蛋白胨，5 g/L 酵母提取物，10 g/L NaCl，pH 7.0。 TB 培養基：12 g/L蛋白胨，24 g/L酵母提取物，體積分數0.4%甘油，17 mmol/L KH2PO4，72 mmol/L K2HPO4，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 構建分泌表達載體 pET22b-pro-MTG（4-284）以載體pET22b-pro-MTG[11]為模板，D4C-up和D4C-down為引物，進行全質粒PCR，得到重組質粒pET-pro-MTG （D4C）。 以載體pET-pro-MTG（D4C）為模板，G284C-up和G284C-down為引物，進行全質粒PCR，獲得重組質粒pET-pro-MTG（4-284）。引物序列見表1，質粒均經過測序驗證。

表1 研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 重組蛋白酶的誘導表達 將轉化子接于含有50 mg/L氨芐青霉素的LB培養基中，37℃過夜培養后轉接至TB培養基中 （含有4 g/L葡萄糖和50 mg/L氨芐青霉素），37℃條件下培養至OD600為0.5~0.6，加入IPTG至終濃度為0.4 mmol/L，20℃條件下誘導40 h。

1.2.3 酶原活化與蛋白質純化 參照報道[12]，收集發酵液，并在發酵液中加入終質量濃度為5 mg/L的中性蛋白酶Dispase，37℃保溫1 h，活化pro-MTG和 pro-MTG（4-284）。活化完成后，硫銨沉淀法（硫酸銨濃度55%~75%）收集目標蛋白，復溶于10 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 6.0）。

將復溶液經過層析柱HiTrap SP HP分離純化，用含0.5 mmol/L NaCl的磷酸鉀緩沖液（pH 6.0）進行線性洗脫。收集含有目標蛋白的峰，并將收集的樣品于25 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）中透析過夜。將透析樣品離心取上清，注入HiTrap Q HP離子柱，并用含有0.5 mmol/L NaCl的25 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）溶液進行線性洗脫，收集目標蛋白。用SDS-PAGE凝膠電泳來檢測目標蛋白純度，Brandford法檢測蛋白質濃度。

1.2.4 檢測蛋白的二硫鍵含量 參照文獻[13]，將蛋白MTG和MTG（4-284），分別稀釋在含有和不含有還原劑（10 mmol/L DTT）的溶液 A（80 mmol/L磷酸鉀緩沖液，質量分數2%SDS，pH 8.0）中，在沸水中煮10 min使蛋白變性。用超濾離心管（Millipore Ultra-15 3K）濃縮蛋白，同時用溶液A洗去DTT，然后取樣測蛋白質濃度。測定各樣品的吸光度值，計算各樣品在有DTT和無DTT存在時，半胱氨酸含量的變化，進而算出二硫鍵的含量。

1.2.5 酶學性質與熱穩定性測定 將重組MTG和MTG（4-284）分別在 37、45、50、55、65 ℃下處理 10 min，然后在冰上冷卻30 min。以N-CBZ-Gln-GLy（30 mmol/L）為底物，用比色法測定MTG酶活[11]。一個單位谷氨酰胺轉胺酶酶活的定義為：37℃時每分鐘催化形成1 μmol L-谷氨酸-γ-單羥基肟酸的酶量。

1.2.6 圓二色譜 用10 mmol/L磷酸鉀緩沖液稀釋至蛋白質質量濃度為0.2 mg/mL，通過MOS-450/AF-CD分光偏振計分別測定重組MTG和MTG（4-284）的T50值。吸收池寬10 mm，檢測波長為222 nm，溫度范圍為40~80℃。

1.2.7 抗胰蛋白酶降解測試 將純化后的蛋白樣品稀釋至0.5 mg/mL并分別加入終濃度為0.1 U/mL的胰蛋白酶。37℃保溫3 h，每隔0.5 h取樣一次，用SDS-PAGE凝膠電泳檢測蛋白的降解程度。

1.2.8 同 源 建 模 通 過 Swiss-Model（http：//swissmodel.expasy.org/）對來源于 S.hygroscopicus的MTG進行同源建模，具體方法參見網站上的說明。模板為來源于Streptomyces mobaranesis的MTG（1IU4），兩者之間的氨基酸序列同源性為79.2%。利用 PROCHECK （http：//nihserver.mbi.ucla.edu/SAVES/）對模型空間結構的準確性進行評估，結果顯示所有的氨基酸都是在合理的位置，表明構建的模型準確性較高。

2 結果與討論

2.1 MTG上二硫鍵位置的選取及質粒構建

S.mobaraense來源的MTG的N端區域對于MTG的熱穩定性起著很關鍵的作用[10]。S.hygroscopicus和S.mobaraense來源的MTG的序列同源性高達79.2%，因此推斷S.hygroscopicus來源的MTG的N端區域對其熱穩定性同樣重要，在該區域設計二硫鍵預期可以提高其穩定性。

通過同源建模獲得S.hygroscopicus來源的MTG的三維結構圖（圖1）。選定N端的Loop區作為改造的目標，利用Disulfide by Design軟件在目標區域預測二硫鍵的氨基酸位點，結果顯示在D4和G284之間可能形成二硫鍵。構建突變體質粒pET-pro-MTG（4-284），以檢測二硫鍵對MTG熱穩定性的影響。

圖1 三維結構圖Fig.1 3D structure comparison of MTG

2.2 MTG和MTG（4-284）的表達、活化與純化

MTG和MTG（4-284）進行胞外表達，經過中性蛋白酶Dispase活化、硫酸銨分級沉淀 （質量分數55%~75%）、陽離子層析和陰離子層析后，獲得了純度較高的MTG和MTG（4-284），SDS-PAGE結果如圖2所示。

2.3MTG和MTG（4-284）的二硫鍵數量測定

二硫鍵的數量是通過對比MTG和MTG（4-284）在還原性環境（經DTT處理）和非還原性環境（未經DTT處理）下的巰基含量來確定的[13]。結果如表2所示，MTG在經DTT處理前后，其巰基含量基本沒有變化。每個MTG內只含有1個巰基，這和已知的蛋白序列只含一個半胱氨酸相一致。MTG（4-284）在經DTT處理后，檢測到的巰基含量約是DTT處理前的3倍，這說明經DTT處理后，一個二硫鍵被打開了，進而釋放出了兩個巰基。實驗結果表明MTG（4-284）內形成了一個二硫鍵。

圖2 純化蛋白電泳圖Fig.2 SDS-PAGE analysis of the purified proteins

表2 MTG和MTG（4-284）的二硫鍵數量Table 2 Disulfide numbers of MTG and MTG（4-284）

2.4 MTG和MTG（4-284）的熱穩定性比較

將 MTG 和 MTG（4-284）在 37、45、50、55、60 ℃分別下處理10 min，再冰浴30 min，進行酶活檢測。如圖 3所示，MTG和 MTG（4-284）在 45℃處理 10 min后，酶活基本沒有降低，表明在該溫度下MTG的熱穩定性較好。MTG在50~60℃的環境下酶活隨著溫度的升高而迅速降低，而MTG（4-284）在55℃下處理10 min后，仍然保留95%的酶活，表明MTG（4-284）的熱穩性有了很大的提高。

圓二色譜技術測定MTG和MTG（4-284）的T50分別為 58 和 65℃（圖 4），表明 MTG（4-284）的蛋白質在變性和解折疊過程中所需的溫度均有所提高，反映出其熱穩定性提高了。這與熱處理后檢測酶活的結果一致。以上結果表明在S.hygroscopicus來源的MTG的N端區域引入二硫鍵可以提高其熱穩定性。

圖3 MTG和MTG（4-284）的熱穩定性Fig.3 Thermostability of MTG and MTG （4-284）at different temperature

圖4 MTG 和 MTG（4-284）的 T50Fig.4 The T50of MTG and MTG（4-284）

2.5 MTG和MTG（4-284）的抗胰蛋白酶降解能力比較

胰蛋白酶經常被用來檢測蛋白酶的抗降解能力。從圖5中可以看出，MTG在經過3 h的胰蛋白酶處理后，目標條帶基本消失，在27 000左右出現一個明顯條帶。而MTG（4-284）在處理3 h后，依然有著比較明顯的條帶，下方也沒有出現降解的蛋白條帶。以上結果顯示MTG（4-284）抗胰蛋白酶降解的能力明顯增強。

MTG（4-284）熱穩性和抗蛋白酶降解的能力都有所提高，進一步表明在N端引入二硫鍵有效的提高了MTG（4-284）的穩定性。

3.6 MTG和MTG（4-284）的酶學性質比較

MTG（4-284）的比酶活略低于MTG；Km和kcat的結果顯示，引入的二硫鍵使得kcat變化略大，Km值變化很小，表明二硫鍵的引入基本沒有影響酶與底物的結合，而是底物進入活性中心后，酶分子完成催化所需的時間受到了一定的影響；MTG（4-284）在熱穩定性提高的同時，最適反應溫度也有所提高。

3 結語

作者通過在MTG的N端區域人工設計并引入二硫鍵，有效提高了其穩定性。圓二色譜檢測結果表明二硫鍵的引入使得其T50由58提高至65℃；酶活力檢測結果表明二硫鍵的引入導致比酶活略有所下降，由13.3 U/mg下降為12.5 U/mg；酶動力學參數表明二硫鍵的引入沒有影響酶與底物的結合過程，而是影響了底物進入活性中心后的催化過程。作者研究結果表明S.hygroscopicus來源的MTG的N端區域對于其穩定性重要影響，而該區域相對遠離活性中心，也比較適合進行分子改造。

圖5 MTG（a）和MTG（4-284）（b）抗胰蛋白酶降解比較Fig.5 Trypsin-resistance of MTG（a）and MTG（4-284）（b）

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