Spn蛋白在結腸癌組織中表達的臨床病理意義

黃 河，羅 恩

結腸癌是消化系統常見的惡性腫瘤之一，其發生與多步驟基因突變及表型改變有關[1]。基因突變導致結腸癌細胞增殖、遷移、侵襲與分化能力發生改變，引起結腸癌發生與發展。經典的信號通路Wnt/b-catenin、TGF-b/BMP、K-RAS、PI3K 等均與結腸癌發生有關[2]。盡管目前診斷技術進步，很多結腸癌可在早期診斷，但仍有大約1/3患者診斷時有轉移，而復發率高達40%[3]。系統性化療目前對結腸癌治療取得一定效果，報道臨床有效反應率在40%～60%[4]。但臨床仍有一些患者對治療無反應，因此，尋找新的有效治療靶點具有重要的意義。

樹突棘親和素（spinophilin,Spn）是一種支架蛋白（scaffolding protein），定位于 17q21.33，這一基因區與細胞微衛星不穩及雜合性丟失密切相關。研究發現，位于 17q21 的 BRCA1，17q21.3 區基因缺失，與乳腺癌，前列腺癌及泌尿系腫瘤密切相關[5]。盡管目前研究報道Spn蛋白與頭頸部癌[6]、肝癌[7]等惡性腫瘤發生有關，但在結腸癌組織中Spn蛋白表達情況及Spn蛋白的臨床病理意義目前并未清楚，為此，本研究對Spn蛋白在結腸癌中表達情況作了深入的分析。

1 材料與方法

1.1 組織標本 收集2013年10月1日～2014年5月1日我院胃腸外科20例手術切除的結腸癌患者腫瘤組織、癌旁組織及距癌組織邊緣＞5 cm的正常結腸組織，標本切除后，部分立即放入液氮，備RNA提取使用；部分采用4%多聚甲醛固定、石蠟包埋，4 μm切片備免疫組化用。同時于我院病理科調取46例結腸癌組織石蠟塊行免疫組化分析。所有患者術前未進行放、化療等抗腫瘤治療，所有標本均經術后病理確診。本組46例結腸癌患者中，男36例，女 10 例，年齡 17～70（54.36±10.30）歲，中位年齡55歲。結腸癌的分期按照2010年第7版國際抗癌協會制定的TNM分期標準。

1.2 主要試劑 總RNA提取試劑盒購于百泰克生物科技有限公司，逆轉錄試劑盒及RT-qPCRSYBR GreenⅠ檢測試劑盒購于TaKaRa公司，兔抗人Spn抗體購于北京博奧森生物技術有限公司，免疫組化SP檢測試劑盒及DAB顯色試劑盒購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 RNA提取及RT-PCR 用Trizol從結腸癌組織和癌旁組織樣本中提取總RNA，濃度及純度用分光光度計檢測，然后按照試劑盒說明將RNA反轉錄為cDNA。RT-PCR中Spn引物序列參考文獻[8]，forward 5＇-GCCCAGCTAATTCAGCAGAC-3＇,reverse 5＇-GGAG CTCCTTGAACTTGTGC-3＇；及內參GAPDH引物序列為 ,5＇-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3＇（forward）,5＇-AGAGGCAGGGATGATGTTCTG-3＇（reverse）。 每 個實驗重復3次。取2 μg總RNA行RT-PCR，按試劑盒說明操作。 mRNA 相對表達量=2-△△Ct，△Ct=Ct目的基因-Ct內參，△△Ct=△Ct癌-△Ct癌旁。

1.4 免疫組化 按照免疫組化SP檢測試劑盒說明書操作：結腸癌石蠟切片用二甲苯脫蠟，然后梯度酒精水化，用pH值為6的0.01 mol/L枸櫞酸鈉溶液在95℃抗原修復10 min，加入1∶100兔抗人Spn單克隆抗體4℃冰箱過夜，PBS洗3次，5 min/次；然后加入二抗室溫作用30 min，DAB顯色，蘇木素復染，透明采用二甲苯溶液，封片用中性樹膠。采用空白一抗作為陰性對照；用已知Spn蛋白表達陽性的乳腺癌切片作陽性對照。

[7]方法評估染色結果，采用染色百分比與染色強度相結合方法。染色百分比評分：0為沒有細胞染色，1為1%～10%細胞染色，2為11%～50%細胞染色，3為51%～80%細胞染色，4為＞80%細胞染色；染色強度評分：0為陰性，1為弱陽性，2為中等，3為強陽性。染色百分比與染色強度評分結果相乘，總分為0～12分，總分≤6為陰性，＞6為陽性。病理閱片結果不一致時，由兩位有經驗的病理醫師重新評估并協商確定。

1.5 Western blot 提取結腸癌與癌旁組織Spn蛋白，取50 μg蛋白做10%SDS-PAGE電泳，轉膜采用聚二氟乙烯（PVDF）膜，采用5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST 洗膜 3 次，15 min/次，然后加入兔抗人 Spn（1∶100）及內參抗體 GAPDH （1∶1000），4 ℃搖床過夜。TBST 洗膜后加入相應 HRP 標記的二抗（1∶2000），室溫孵育2 h，然后采用ECL化學發光試劑盒進行發光顯影。

1.6 統計學方法 應用SPSS 17.0統計軟件進行統計學分析，計量數據以x±s表示，比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結腸癌及癌旁組織中Spn表達情況 Q-PCR檢測結果表明，20例結腸癌組織及癌旁組織中，Spn的mRNA僅在2例增高，增高率為10%；Spn的mRNA 在結腸癌組織相對表達量為 1.03±0.16，而在癌旁組織中相對表達量為 3.86±0.32。免疫組化檢測結果提示，Spn蛋白主要定位于細胞漿或胞膜，呈淡黃至棕黃，團塊或片狀分布，癌組織中呈弱陽性或不著色。癌旁組織的Spn陽性率為90%（18/20），明顯高于結腸癌組織的 43.5%（20/46）（圖 1）。 Western blot顯示結腸癌旁組織Spn蛋白明顯高于結腸癌組織（圖 2）。

圖1 結腸癌旁組織及不同分化程度的結腸癌組織Spn表達（Envision×200）A：結腸癌旁組織Spn表達強陽性；B：高分化結腸癌組織中Spn表達較弱；C：低分化結腸癌組織Spn表達陰性

圖2 Western blot檢測結腸癌與癌旁組織Spn蛋白表達1：癌組織；2：癌旁組織

2.2 結腸癌組織中Spn低表達與臨床病理特征關系 46例結腸癌組織標本中，Spn低表達20例。分析Spn蛋白表達與患者臨床病理特征關系，發現Spn蛋白表達情況與患者性別、年齡無關，但與患者腫瘤分化程度（P=0.002）和浸潤情況（P=0.024）及淋巴結轉移情況（P=0.014）有關。盡管Spn蛋白表達與患者遠處轉移無統計學差異（P=0.141），但有轉移患者70.6%Spn蛋白陰性表達，明顯高于48.3%的無遠處轉移患者。見表1。

表1 Spn蛋白表達與結腸癌臨床病理特征的關系

3 討論

Spn定位于染色體17q21.33，目前研究發現這一區域含有較多的抑癌基因，包括BRCA1、NME1、prohibitin等，其突變被認為與惡性腫瘤發生有關[8]。目前17q21研究較多的是BRCA1，其突變在乳腺癌等惡性腫瘤中發揮重要作用。而最近研究發現，惡性腫瘤中Spn缺失可能在腫瘤發生中有重要的作用，在肺癌中報道Spn突變率高達53%[9]。但目前已知Spn可與多達30種蛋白相互作用，包括蛋白磷酸酶 1（protein phosphatase 1，PP1）及 F-actin。

其他的信號通路包括細胞骨架和細胞黏附分子、酶、G蛋白信號通路、膜受體、離子通路和腫瘤抑制蛋白ARF等。Spn也調節著跨膜蛋白，通過p70S6與細胞內的促有絲分裂的信號事件相關。Spn可導致pRb磷酸化，使pRb抑制腫瘤功能喪失有關，導致惡性腫瘤增殖。Spn可通過與PP1結合形成復合體，抑制PP1磷酸酶活性，通過干擾線粒體紡錘體，導致膠質瘤細胞死亡。本研究發現，結腸癌組織中Spn表達較癌旁明顯減低，而且分化較差的結腸癌組織中Spn表達較分化高的Spn蛋白表達低，表明結腸癌中存在Spn缺失，而且Spn缺失與結腸癌惡性進展密切相關。

P53突變可能與Spn缺失導致惡性腫瘤進展密切相關，Spn缺失可促進腫瘤發展，Spn缺失同時合并P53缺失可明顯促進腫瘤發展。在肺癌中，Spn缺失伴隨著明顯的P53突變。P53突變促進Spn缺失致腫瘤發生的機制可能與P53增殖抑制作用喪失，導致Spn缺失使惡性腫瘤細胞增殖密切相關。而結腸癌中P53突變率高達50%，P53突變導致腫瘤細胞化療藥物耐藥，與P53調亡作用喪失有關，提示結腸癌中P53突變可能更加促進Spn缺失導致的結腸癌細胞增殖，促進結腸癌進展。

惡性腫瘤中Spn表達降低的機制除了堿基缺失及基因突變外，研究發現miRNA調控異常也是重要原因。目前發現miRNA-106a可靶向作用于Spn，惡性腫瘤中miRNA-106a與Spn存在相反的關系，miRNA-106a表達增高可促進Spn表達減低，促進惡性腫瘤發生、發展。

總之，本研究發現結腸癌中Spn表達較癌旁組織中低，而且低表達Spn與患者不良預后有關，表明Spn缺失可能在結腸癌惡性進展中發揮重要作用。通過調控Spn蛋白表達，可能對結腸癌的治療有一定的價值。

【參考文獻】

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