HPLC法同時(shí)測(cè)定氯霉素氫化可的松滴耳液中兩組分含量

祝 輝，羅自力，杜建紅，何德云，鐘元高，申冬妮，李 佳

氯霉素氫化可的松滴耳液是常用醫(yī)院制劑，收載于《中國醫(yī)院制劑規(guī)范》西藥制劑（第二版）[1]。其主要成分為氯霉素和氫化可的松，具有抗炎、抗過敏作用，臨床用于中耳炎的治療。現(xiàn)行檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)采用紫外分光光度法測(cè)定制劑中氯霉素含量，卻未對(duì)氫化可的松含量作具體規(guī)定。文獻(xiàn)報(bào)道采用HPLC法同時(shí)測(cè)定氯霉素氫化可的松滴耳液中兩組分含量[2-4]，所選用的流動(dòng)相為不同比例甲醇-水，氯霉素和氫化可的松在5 min內(nèi)先后出峰，特別是氯霉素出峰時(shí)間約3 min，易受溶劑峰干擾。本研究參考《中國藥典》2010版（二部）中氯霉素和氫化可的松原料藥及其制劑含量測(cè)定方法[5-6]，以離子對(duì)試劑——庚烷磺酸鈉為流動(dòng)相調(diào)節(jié)劑，建立了同時(shí)檢測(cè)氯霉素和氫化可的松含量的HPLC方法，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，為制劑標(biāo)準(zhǔn)提高提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀（Agilent1100，美國），優(yōu)普系列超純水器（UPT-Ⅰ，成都超純科技有限公司），超聲波清洗器（KQ5200E，昆山市超聲儀器有限公司），電子分析天平（BT25S，賽多利斯，德國）。

1.2 試藥 氯霉素對(duì)照品（130555-200602，中國藥品生物制品檢定所，純度99.4%），氫化可的松對(duì)照品（100152-200602，中國藥品生物制品檢定所，純度：100%），庚烷磺酸鈉（20130316，成都市科龍化工試劑廠），二甲基甲酰胺（20110309，重慶中渝化工試劑廠），冰醋酸（20130606，成都市科龍化工試劑廠），乙腈（A998-4，F(xiàn)isher公司），超純水（自制），氯霉素氫化可的松滴耳液（批號(hào)：130820A、130911A、131025A，某醫(yī)院自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 混合對(duì)照品溶液制備 精密稱取氯霉素對(duì)照品 10.20 mg、氫化可的松對(duì)照品 10.11 mg，分別置10、50 ml量瓶中，加水溶解，稀釋并定容至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液A、B；再分別精密量取儲(chǔ)備液A 1 ml，儲(chǔ)備液 B 1 ml置10 ml量瓶中，加水稀釋并定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 供試品溶液制備 精密量取氯霉素氫化可的松滴耳液1 ml置50 ml量瓶中，加水稀釋，定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 陰性對(duì)照溶液制備 按照處方工藝制備陰性對(duì)照，參照“2.1.2”項(xiàng)下制備成溶液。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn) 色譜柱：WondaSil色譜柱（C18-WR；4.6 mm×250 mm；5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%庚烷磺酸鈉溶液（取0.1%的庚烷磺酸鈉溶液500 ml與二甲基甲酰胺5 ml、冰醋酸0.5 ml混勻，超聲脫氣 5 min，即得）（26∶74），檢測(cè)波長(zhǎng) ：0～16 min 為 278 nm，16～20 min 為 245 nm，20～25 min 為 278 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣量：20 μl。系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：陰性對(duì)照在氯霉素和氫化可的松出峰處無干擾（圖1）。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液 10、15、20、25、30、40 μl，分別注入 HPLC 儀，記錄出峰時(shí)間與峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（X，μg/ml）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得氯霉素線性回歸方程式為 Y=27.021X+9.71，r=1 （n=6）；氫化可的松線性回歸方程式為 Y=40.867X-7.53，r=0.9999（n=6）。 結(jié)果表明：氯霉素在 4.08～204 μg/ml，氫化可的松在 10.11～40.44 μg/ml范圍內(nèi)，與峰面積均呈良好的線性關(guān)系。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)為 130820A樣品 6份，按“2.1.2”供試品溶液制備方法得供試品溶液，照“2.2”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)行含量測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果：氯霉素、氫化可的松峰面積RSD分別為0.5%、0.6%（n=6），表明該方法重復(fù)性試驗(yàn)好。

圖1 高效液相色譜

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件依次連續(xù)進(jìn)樣5次，每次20 μl，記錄峰面積，結(jié)果：氯霉素、氫化可的松峰面積的RSD分別為0.5%、0.7%（n=5），表明該方法精密度試驗(yàn)好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號(hào)為130820A樣品稀釋溶液， 室溫下存放，1 d 內(nèi)依次在第 2、5、8、12、16、20、24 h，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，結(jié)果：氯霉素、氫化可的松峰面積的RSD分別為0.9%、1.0%（n=7），表明該樣品在 24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 加樣回收試驗(yàn) 精密量取已知含量的樣品9份（批號(hào)：130820A，含氯霉素和氫化可的松分別為2.505 mg/ml、0.512 mg/ml）， 每 份 1 ml， 按 80% 、100%、120%比例，分別加入氯霉素和氫化可的松對(duì)照品適量，照“2.1.2”供試品溶液制備方法稀釋至刻度，搖勻，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.4 樣品含量測(cè)定 將130820A、130911A、1310 25A 3個(gè)批次樣品按照“2.1.2”方法處理，每個(gè)批次平行取2份，制備供試品溶液；再精密稱取對(duì)照品2份，照“2.1.1”方法處理制備對(duì)照品溶液，每份供試品溶液及對(duì)照品溶液按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件方法依次進(jìn)樣2次，記錄峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算樣品百分含量，結(jié)果見表2。

表2 氯霉素氫化可的松滴耳液的含量測(cè)定結(jié)果（mg/mI）

3 討論

氯霉素氫化可的松滴耳液來源于醫(yī)院制劑，主要成分為氯霉素和氫化可的松，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)采用紫外分光光度計(jì)法測(cè)定氯霉素含量，并未對(duì)氫化可的松含量做具體規(guī)定，不能對(duì)該藥品進(jìn)行全面質(zhì)量監(jiān)控，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有一定局限性。已有文獻(xiàn)報(bào)道采用HPLC方法同時(shí)檢測(cè)氯霉素和氫化可的松含量，但文獻(xiàn)方法中兩組分出峰時(shí)間短，特別是氯霉素出峰時(shí)間過快（約3 min），存在溶劑峰干擾。本研究選擇庚烷磺酸鈉作為離子對(duì)調(diào)節(jié)劑，有效提高了兩組分保留時(shí)間，出峰時(shí)間優(yōu)化為15 min左右，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，新建HPLC方法適合用于同時(shí)檢測(cè)氯霉素和氫化可的松含量。

檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇：以流動(dòng)相為空白，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，掃描氯霉素和氫化可的松紫外吸收，結(jié)果顯示氯霉素、氫化可的松分別在278 nm、245 nm有最大吸收峰。因此，本研究設(shè)定初始檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm，待氯霉素出峰之后，變換檢測(cè)波長(zhǎng)為245 nm，有效提高了對(duì)氯霉素和氫化可的松的檢測(cè)靈敏度。

[1]中華人民共和國衛(wèi)生部藥政局.中國醫(yī)院制劑規(guī)范（西藥制劑第二版）[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，1995：158-159.

[2]李小燕.HPLC法測(cè)定氯霉素氫化可的松滴耳液中兩組分的含量[J].色譜,1998,16（1）:71-73.

[3]陳豪，劉芳群，曾建國,等.HPLC法測(cè)定氯霉素氫化可的松滴耳液中兩組分的含量[J].中國藥師，2010,4（13）：585-586.

[4]金克林.高效液相色譜法測(cè)定氯霉素氫化可的松滴耳液中氯霉素和氫化可的松的含量[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2011,6（20）：507-508.

[5]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（二部）[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：1029-1032.

[6]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（二部）[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：550-552.