茸菖膠囊對幼年大鼠癲癇后NRSF和BDNF蛋白表達的影響*

楊常泉，王 偉，馬 融

（天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300193）

茸菖膠囊對幼年大鼠癲癇后NRSF和BDNF蛋白表達的影響*

楊常泉，王 偉，馬 融

（天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300193）

[目的]研究茸菖膠囊對幼年大鼠癲癇后神經元限制性沉默因子（NRSF）和腦源性神經營養因子（BDNF）蛋白表達的影響。[方法]建立戊四唑點燃癲癇模型，分為中藥高、中、低劑量組、西藥組、模型組和空白組，用蛋白免疫印跡雜交法檢測各組NRSF和BDNF蛋白的變化。[結果]幼年大鼠致癇后模型組海馬NRSF和BDNF蛋白表達升高，中藥高劑量組可顯著降低大鼠海馬齒狀回NRSF和BDNF蛋白表達（P＜0.01），作用優于西藥組和其他中藥組。[結論]中藥復方茸菖膠囊抗癲癇及改善癲癇后認知障礙機制可能與調控組蛋白乙酰化修飾及其所介導的神經元基因表達有關。

癲癇；海馬；茸菖膠囊；腦源性神經營養因子；神經元限制性沉默因子

組蛋白乙?；瘏⑴c了癲癇發作及癲癇后認知功能的下降。神經元限制性沉默因子（NRSF）與組蛋白乙?；芮邢嚓P，腦源性神經營養因子（BDNF）有與NRSF結合的神經限制性沉默元件（NRSE），其轉錄調控與組蛋白乙酰化密切相關[1-2]。本研究采用出生后16 d（P16）的SD大鼠建立戊四唑點燃癲癇模型及茸菖膠囊的干預作用下，應用蛋白免疫印跡雜交法檢測NRSF、BDNF蛋白在大鼠海馬區表達變化，探討中藥復方茸菖膠囊改善癲癇后認知障礙的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及藥品 16日齡Sprague-Dawley大鼠（P16）48 只，清潔級，體質量（50±10）g，雌雄各半，由軍事醫學科學院實驗動物中心提供（動物合格證號：SCXK（軍）2007-005）。茸菖膠囊由天津市石天藥業公司提供（批件號：津藥制字Z20070735號），規格：每粒0.33 g，50粒/瓶。丙戊酸鈉口服溶液由賽諾菲安萬特制藥有限公司提供（國藥準字H20041435），規格 300mL∶12 g。戊四唑由 Simga 公司提供（批號：P6500）。

1.2 模型制備與評價 采用戊四唑慢性點燃癲癇動物模型，參考王麗等[3]方法并加以改進。從大鼠出生后17～45 d（P17～P45）開始，用戊四唑亞驚厥劑量37mg/kg腹腔注射，每日1次，連續28 d。停藥1周后（P52）再以相同劑量戊四唑腹腔注射，采用Racine評分法[4]凡顯示連續連續5次Ⅱ級及以上驚厥的大鼠，被認為達到點燃標準。將出線Ⅳ級以上驚厥大鼠繼續進行Morris水迷宮實驗[5]篩選認知障礙模型大鼠。

1.3 分組與處理 共設6組，包括：空白對照組、癲癇模型組、中藥治療組（茸菖膠囊低、中、高3個劑量組，劑量 1∶2∶4）；西藥對照組。各組給藥劑量按人與大鼠體表面積換算公式計算。1）空白對照組：不作處理。2）癲癇模型組：灌服生理鹽水10mL/kg，每日兩次，持續28 d。3）中藥治療組：將茸菖膠囊按生藥含量7.68、3.84、1.92 kg/L分別配制成相應濃度的藥液，3組均按10 mL/kg灌藥，每日2次，持續28 d。4）西藥對照組：丙戊酸鈉400mg/kg給藥，每日2次，持續28 d。

1.4 標本采集 各組大鼠出現驚厥發作后1 h，斷頭剝離海馬組織，轉至EP管，液氮固定，-80℃低溫保存。

1.5 蛋白免疫印跡檢測 采用蛋白提取試劑盒加入磷酸酶抑制劑提取細胞總蛋白，BCA試劑盒進行蛋白定量，SDS-PAGE電泳，半干法轉膜，封閉，一抗孵育，洗膜，加入HRP標記的二抗孵育，ECL反應、膠片曝光。加入HRP標記的GAPDH抗體同時檢測GAPDH含量。

1.6 統計學分析 應用SPSS18.0軟件包進行統計學處理，全部實驗數據用均數±標準差（±s）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnett’s T3法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組動物驚厥行為觀察 在腹腔注射亞驚厥劑量戊四唑7 d逐漸有興奮性增高的表現，如籠內跑跳明顯增加，注射第10天起陸續出現如眨眼、動須、點頭、頭部抽搐等程度不等的驚厥發作，注射20 d以后呈逐漸加重趨勢，尤其是注射30min后驚厥表現明顯，出現前肢抬起，全身痙攣抖動等，精神狂躁不安，在飼養籠內上下翻跳及狂奔伴有嘶叫,失去體位控制。而對照組大鼠無癇樣發作。

2.2 茸菖膠囊對海馬組織NRSF蛋白表達的影響 癲癇模型組大鼠海馬組織NRSF蛋白相對表達顯著高于其他各組（P＜0.01）；中藥高劑量組大鼠海馬齒狀回NRSF蛋白表達顯著低于中藥中劑量組、中藥低劑量組及西藥組（P＜0.01），西藥組大鼠海馬齒狀回NRSF蛋白表達顯著低于中藥中劑量組及中藥低劑量組（P＜0.01），而顯著高于中藥高劑量組（P＜0.01）。見表 1。

表1 各組大鼠海馬組織NRSF蛋白表達的比較（±s）Tab.1 Expression of NRSF protein in hippocampus of rats in each group（±s）

表1 各組大鼠海馬組織NRSF蛋白表達的比較（±s）Tab.1 Expression of NRSF protein in hippocampus of rats in each group（±s）

注：與空白對照組比較*P＜0.01；與癲癇模型組比較#P＜0.01，與西藥對照組比較△P<0.05。

組別 動物數 NRSF空白對照組 8 0.57±0.06癲癇模型組 7 1.41±0.06*西藥對照組 7 1.12±0.06*#中藥高劑量組 8 0.90±0.04*#△中藥中劑量組 8 1.22±0.04*中藥低劑量組 8 1.30±0.047*

2.3 茸菖膠囊對海馬BDNF蛋白表達的影響 其他各組大鼠海馬組織BDNF蛋白表達顯著高于空白對照組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。除中藥中、低劑量組外，其他各組大鼠海馬組織BDNF蛋白表達與癲癇模型組比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。與西藥對照組比較，中藥高劑量組大鼠海馬齒狀回BDNF蛋白表達無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 各組海馬BDNF蛋白表達的比較（±s）Tab.2 Expression of BDNF protein in hippocampus in each group（±s）

表2 各組海馬BDNF蛋白表達的比較（±s）Tab.2 Expression of BDNF protein in hippocampus in each group（±s）

注：與空白對照組比較*P＜0.01；與癲癇模型組比較#P＜0.01，與西藥對照組比較△P<0.05。

組別 動物數 NRSF空白對照組 8 0.52±0.10癲癇模型組 7 0.95±0.34*西藥對照組 7 0.73±0.11*#中藥高劑量組 8 0.70±0.18*#中藥中劑量組 8 0.80±0.04*#△中藥低劑量組 8 0.87±0.26*△

3 討論

組蛋白的乙?；且粋€與基因轉錄活性高低密切相關的動態過程，組蛋白乙?；郊捌湔{控致癇相關基因的表達是癲癇發作及癲癇后認知功能下降的重要調節機制之一[6-7]。NRSF與組蛋白乙?；芮邢嚓P，在神經系統發生和癲癇發病中起著十分重要的作用。NRSF招募共阻遏子Sin3A及CoREST，后兩者再招募HDACs到核小體附近，引發組蛋白低乙酰化狀態，進而抑制了轉錄。Ballas等[8]報道NRSF及其所介導的基因表達參與了癲癇發生及癲癇后認知功能的下降。BDNF與癲癇后認知功能的下降密切相關。BDNF基因有與NRSF結合的NRSE，其轉錄調控與組蛋白乙酰化密切相關。癇性發作激發BDNF的轉錄上調，促進了海馬苔蘚纖維出芽及突觸重組[9-10]。

抗癲癇藥丙戊酸（VPA）已被證實是HDACs抑制劑，其可以增加了小鼠海馬區H3的乙?；?，選擇性激活了神經元BDNF啟動子，抑制癲癇齒狀回的NRSF表達，使NRSF依賴基因表達正常化，阻止癲癇發作引起的神經發生，減少認知功能障礙[11]。

馬融教授認為小兒癲癇伴認知障礙的病機關鍵在于“腎精虧虛、風痰閉阻”，治療上以“益腎填精、豁痰熄風”立法，前期臨床研究表明茸菖膠囊不僅可以有效減輕癲癇的造成的認知障礙，而且可以有效控制癲癇的發作[12]。本實驗研究結果發現幼年大鼠致癇后模型組海馬NRSF和BDNF蛋白表達升高，中藥高劑量組可顯著降低大鼠海馬齒狀回NRSF和 BDNF蛋白表達（P＜0.01），作用優于西藥對照組和其他中藥組。提示癲癇后神經發生與組蛋白乙?；揎椕芮邢嚓P，中藥填精充髓、豁痰熄風法復方茸菖膠囊通過調控組蛋白乙?；秸{控神經發生進而改善癲癇大鼠認知障礙可能是其抗癇增智作用的多靶點機制之一。

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Effectof Rongchang capsuleson expressionsof NRSF and BDNF in hippocam pusof epilepsy rats

YANGChang-quan,WANGWei,MARong
（The FirstAffilited Hospitalof Tianjin University of TraditionalChineseMedicine,Tianjin 300193,China）

[Objective]Toexplore theeffectofRongchang capsules(RCC)on the protein expression ofneuronal restricted silencing factor(NRSF)and brain-derived neurotrophic factor(BDNF)in hippocampusafter pentylenetetrazole(PTZ)induced epileptic seizure in young rats.[Methods]Toestablish the PTZkindlingmodelofepilepsy,the ratswere randomly divided into normalgroup,modelgroup,valproic acid sodium(VPA)group and RCC low,middle,high dosage group.The expression ofNRSF protein and BDNF proteinwere detected by theWestern blot hybridization assay.[Results]The expression of NRSF protein and BDNF protein in hippocampus of rats inmodel groupswere significantly higher than those in the blank group,and the differencewas statistically significant(P<0.05).Each treatgroup could reduce the expression,butRCC high dose group was better than VPA and RCC low,middle dosage group(P<0.05).[Conclusion]Themechanism of RCC antiepilepsy and improvement cognitive impairmentafter epilepsymay be related to the inhibition of NRSF and BDNFprotein expression in juvenile rathippocampusafterepilepsy.

epilepsy;hippocampus;Rongchang capsule;brain derived neurotrophic factor;neuronal restricted silencing factor

R742.1

A

1672-1519（2015）09-0555-03

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.09.12

國家自然科學基金面上項目（81173301，30973772）；國家自然基金青年科學基金項目（81001539）；天津市應用基礎及前沿技術研究計劃（10JCZDJC20600，11JCYBJC12300）。

楊常泉（1975-），男，博士，副主任醫師，主要研究方向為中醫藥治療小兒腦病的研究。

馬 融，E-mail:mr1974@163.com。

2015-04-26）

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