泡菜中高產蛋白酶乳酸菌的篩選鑒定及其酶學特性初步研究*

胡玲萍，裘迪紅，王鑫鈺

1(寧波大學，浙江寧波，315211)2(浙江醫學高等專科學校，浙江杭州，310053)

泡菜發酵過程中有多種微生物參與，乳酸菌作為優勢菌種，在泡菜的整個發酵過程中起到非常重要的作用［1－3］。Pederson 和 Albury 等［4－5］發現，在酸白菜、酸黃瓜等泡菜的發酵早期明串珠菌非常活躍，接著是短乳桿菌、啤酒片球菌和植物乳桿菌大量產酸，最后是植物乳桿菌結束發酵過程。乳酸菌胞外產物很多，目前研究的大多是胞外多糖的性質［6］，而對胞外蛋白酶研究較少。乳酸菌胞外酶通過水解作用，使多糖、蛋白質、核酸等天然高聚物裂解，逐步變為可穿過細胞質膜而被吸收利用的小分子物質，通常1株乳酸菌菌株可以分泌一種或多種胞外蛋白酶［7－8］。溫度、pH、金屬離子、有機物等因素都會影響胞外酶的活性。

在實際生產中，乳酸菌一般被認為是安全的細菌(generally regarded as safe，GRAS)［9，因此乳酸菌在食品中應用時可省去后提取等繁瑣工藝從而提高經濟效益。乳酸菌作為發酵菌種的幾個重要指標能力分別是:產酸能力，產香能力，蛋白質水解能力，產生帶有黏性的胞外多糖能力以及抑菌能力。因此，篩選用于發酵食品的菌株應符合食品的全面的感官性質，在考慮產酸速度和產酸量的同時，還要注意對發酵乳制品風味有重要影響的風味化合物的形成［10］。

本研究從傳統發酵泡菜中分離乳酸菌，通過脫脂牛乳平板試驗并結合福林酚法測定蛋白酶活力，篩選出高產蛋白酶菌株，從中提取胞外蛋白酶并對其酶學特性進行了初步的研究，目的是通過了解其蛋白質的水解能力，為該乳酸菌發酵劑的制備提供理論依據，為泡菜中植物乳酸菌胞外蛋白酶在新型發酵行業中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

從傳統泡菜中分離得到的乳桿菌。

1.1.2 主要試劑及培養基

CaCO3、福 林 酚 試 劑、NaH2PO4· 12H2O、Na2HPO4·12H2O、Na2CO3、三氯醋酸(TCA);酸化MRS瓊脂培養基、脫脂牛乳平板、MRS肉湯;dNTP、TapDNA聚合酶、10×buffer、Mg2+等，大連寶生物公司;PCR產物回收試劑盒、氨芐青霉素(Ampicillin，Amp)、胰蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物(Yeast Extract)、NaCl、瓊脂粉、牛血清蛋白、考馬斯亮藍R-250、葡聚糖Sephadex-75等，上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.1.3 主要儀器設備

H-205R臺式高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司;QHZ-12A組合式恒溫振蕩培養箱;紫外分光光度計，上海瀘西分析儀器廠有限公司;LDZX-50KB立式高壓滅菌鍋，上海申安醫療器械廠;DYY-Ⅲ垂直板電泳儀，北京六一儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 泡菜中乳桿菌的分離純化

將泡菜汁進行10倍梯度稀釋，選取適宜的稀釋度，用經滅菌并冷卻到45～50℃的含有Ca2CO3的酸化MRS瓊脂培養基傾倒平板，30℃培養48 h，挑取有溶鈣圈的菌落，在MRS平板上反復劃線，直到得到單菌落;在平板上劃線分離，反復純化，經革蘭氏染色，挑出革蘭氏陽性菌。

1.2.2 產蛋白酶乳桿菌的初篩

將實驗室從泡菜中分離得到的乳桿菌菌株進行復壯，然后各取10 mL培養液5 000 r/min離心10 min，取50 μL上清液添加到脫脂牛乳瓊脂培養基的孔里，孔徑為6.0 mm，隨后將其置于35℃培養48 h，最后挑選出在脫脂牛乳平板上產生透明圈較大的乳桿菌保存，每株乳桿菌進行3個平行實驗［11］。

1.2.3 產蛋白酶乳桿菌的復篩

將初篩選擇的菌株接種至20 mL新鮮的MRS肉湯于35℃培養72 h，取5 mL發酵液于8 000 r/min、4℃下離心20 min，所收集的上清液即為粗酶液，進行蛋白酶活力的測定。每株菌進行3次平行實驗，取其平均值。確定高產蛋白酶的乳桿菌株［10］。

1.2.4 蛋白酶活力的測定

粗酶液和純化的酶液都采用福林酚法［13］測定蛋白酶活性。在680 nm處測定樣品酶液的吸光值，進而換算成蛋白酶活性。蛋白酶活性單位定義為:1 mL酶液在40℃、pH7.5的條件下，每分鐘催化分解蛋白質生成1 μg酪氨酸所需的酶量為1個酶活性單位，以U/mL表示。

1.2.5 菌株L4的PCR鑒定

實驗直接用菌體作為模板，不進行基因組DNA的提取步驟。用無菌移液器挑取適量活化后的單菌落L4，加入20 μL PCR水中，充分振蕩后稍離心，作為PCR模板，反應體系見表1。

PCR循環參數:94℃預變性3 min，94℃ 60 s(變性)，50 ℃ 60 s(退火)，72 ℃ 120 s(延伸)，30個循環，72℃延伸10 min。反應完畢取5 μL反應液進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統下分析結果。

表1 PCR反應體系Table 1 The components of PCR reaction

目的片段與載體的連接:參照大連寶生物工程有限公司的pMD18-T Vector試劑盒說明書。在微量離心管中配制下列連接反應體系(見表2)，16℃下過夜。

表2 連接反應體系Table 2 The components of ligation reaction

重組質粒的轉化:將5 μL的過夜連接反應液加入到30 μL感受態細胞中，在冰中靜置30 min，42℃水浴45 s，再冰中靜置1min，加入300 μL LB(Amp－)培養液，37℃、140 r/min搖床培養60 min。

陽性克隆的初步篩選:將120 μL菌液加入含有Amp的LB瓊脂平板，均勻涂布，待完全吸收后倒置于37℃培養箱中，12～16 h后觀察有無白色單菌落生長。

PCR法直接篩選重組陽性克隆:PCR反應體系擴大到150 μL和反應程序與PCR擴增相同，產物做凝膠電泳檢測以篩選重組陽性克隆。

序列測定:將經過鑒定符合的陽性菌落加到含Amp的LB培養液中過夜培養，加甘油保存菌液，由上海英駿生物技術有限公司測定序列。

1.2.6 植物乳桿菌胞外蛋白酶的提取

將發酵液4 500 r/min離心12 min后除去菌體，測上清液pH值。用0.22 μm/0.45 μm濾膜過濾，濾液存放于－20℃冰箱中備用。將上述培養過濾液取出置室溫融化后，緩慢加入(NH4)2SO4粉末至80%飽和度，4℃過夜，10 000 r/min離心15 min，收集沉淀。將沉淀溶解于40 mL 0.02 mol/L pH7.8的Tris-HCl緩沖液，4℃透析24 h(每8 h換透析液1次)，12 000 r/min離心20 min，上清液即為粗蛋白液，其間充分換水并攪動。

1.2.7 胞外蛋白酶純化

將收集的上述酶溶液充分透析，并用PAEG濃縮至體積為6 mL左右，然后加入到用0.02 mol/L pH7.8 Tris-HCl平衡的Sephadex G-75柱，用相同緩沖液洗脫，流速15 mL/h，每管1 mL收集洗脫液，測定蛋白吸收和酶活力。收集酶活力集中部分，冷凍干燥。

1.2.8 胞外蛋白酶分子量確定

將SDS-聚丙烯酰胺凝膠裝配好，注入足量的SDS-PAGE電泳緩沖液;取20 μL樣品加入5 μL 5×SDS-PAGE上樣緩沖液混勻;于沸水浴中處理2～5 min;離心 (10 000 g，1 min)，取20 μL 上清液加到加樣孔中;將電壓調至160 V(恒壓)，當染料電泳至底部即可停止。

將電泳完畢的凝膠轉移至干凈的中型培養皿，加入20 mL考馬斯亮藍染色液，室溫緩慢振蕩15～20 min(適當加熱可加速)，傾去染色液，蒸餾水洗1次;加入50 mL脫色液，于室溫緩慢振蕩20～30 min或直至脫色完全為止。

1.2.9 胞外蛋白酶酶學特性分析

經過純化的ECPase于55、100℃下分別處理5、10、20、35、50 min，測定酶活力。將 ECPase 分別于在0，20，30，37，50，56，60，70，80，90 和 100 ℃ 下處理 1 h，再測定其酶活性，繪制酶活性變化曲線。

分別用pH 2.2的碳酸氫鈉－檸檬酸緩沖液，pH 11.0的甘氨酸－氫氧化鈉緩沖液，pH 8.0的Tris-HCl緩沖液配成 pH 值分別為 2.5，3，4，5，6，6.5，7，7.5，8，9，10，11 的緩沖液，加純化的 ECPase，測活力變化曲線。

選擇性抑制劑50 mmol/L金屬螯合劑乙二胺四乙酸(EDTA)、100 mmol/L絲氨酸蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF)與純酶液以1∶1(V/V)混合，于26℃溫浴1 h后，以1%的酪蛋白為底物，15%的三氯乙酸終止反應，測酶活性。

將濃度為 1 mmol/L 的 CoCl2、ZnSO4、MnCl2、BaCl2、FeCl3、CuSO4及 MgCl2等金屬鹽溶液分別和ECPase作用，32℃下處理0.5 h，再測定其酶活性。對照組為不加金屬鹽的ECPase樣品，空白則為經過沸水浴滅活的樣品。

2 結果

2.1 泡菜中乳桿菌的分離結果

通過平板分離培養，從酸化MRS培養基上挑取產生Ca2CO3溶解圈，乳白色或黃色，菌落直徑1～3 mm，表面光滑，邊緣較整齊的菌落在MRS培養基上反復劃線，挑取單菌落進行革蘭氏染色、鏡檢。選擇G+菌，呈桿狀，以單生、成對或短鏈排列的菌株，從而共分離出16株，分別標記為L1－L16，保藏于斜面。

2.2 產蛋白酶乳桿菌的篩選

通過脫脂牛乳平板試驗，從分離得到的16株乳桿菌菌株中篩選出12株產蛋白酶乳桿菌，結果見圖1。

圖1 脫脂乳平板上產生的透明圈Fig.1 The transparent circles on skim-milk culture

將初篩得到的12株產蛋白酶的菌株按1.2.4的方法培養，采用福林酚法測定其蛋白酶活性，結果如表3所示。不同的菌株產蛋白酶活性存在差異，其中尤其以L4菌株的蛋白酶活性最高，達到25.12 U/mL。因此，本研究以L4菌株作為研究菌株，并對其進行PCR鑒定。

表3 產蛋白酶菌株的篩選結果Table 3 Results of screening of the protease-producing bacterial strains

2.3 菌株L4的PCR鑒定

2.3.1 PCR擴增結果

以L4菌體為模板，利用引物:5’-GTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAA-3’和 5’-GTGATC-CAGCCGCAGGTTCTCC-3’對L1的16S rDNA片段進行PCR擴增，結果見圖2。從圖2可以看出，PCR反應得到的擴增產物分子量在800bp左右，符合16S rDNA片段大小，說明所選用的PCR反應體系和反應程序都可達到預期目的。

圖2 PCR擴增結果Fig.2 PCR product

2.3.2 PCR產物重組陽性克隆的篩選

從圖3凝膠成像圖中可以看出，PCR反應得到的擴增產物的分子量在800 bp左右，且擴增效果較好，證明所挑取的克隆菌確實含有插入的目的片段，說明本次克隆操作是成功的，沒有發生污染。

2.3.3 測序結果

使用NCBI網站對該菌的16S rDNA序列與數據庫中各種菌的16S rDNA序列進行比對，并使用BLAST在數據庫中進行同源性搜索，發現該菌株的堿基序列與多株植物乳桿菌(JX025073.1、JQ236622.1、JN680707.1、AB362759.1、EU559598.1 等)相應 16S rDNA序列99%相似，可以鑒定L4為植物乳桿菌。

2.4 培養時間對蛋白酶活力的影響

將L4菌株接種于MRS培養基，置于30℃培養48 h，并且在培養時間為4、8、12、16、20 和24 h 處測其粗蛋白酶活力。結果如圖5所示。

隨著培養時間的延長，菌株產生的蛋白酶活力不斷增強，在20 h左右達到最高，此后呈下降趨勢。

圖5 培養時間對產蛋白酶的影響Fig.5 Effect of culture time on protease production

2.5 胞外蛋白酶分子量確定

電泳完畢后的凝膠用考馬斯亮藍染色液染色、脫色液脫色后用凝膠成像儀成像分析，確定胞外蛋白酶的分子量為40 kDa。成像后的圖片見圖6。

圖6 純化ECPase的PAGE圖譜Fig.6 PAGE electrophore-togram of the purified ECPase

2.6 酶活力標準曲線繪制

用福林酚法在680 nm處測OD值建立胞外蛋白酶酶活力標準曲線。標準曲線方程為Y=0.006X+0.002(R2=0.999)。

2.7 pH對胞外蛋白酶酶活性的影響

將胞外蛋白酶在37℃與不同pH緩沖液都作用1 h，用福林酚法測蛋白酶680 nm處OD值，繪制酶活力曲線。從圖7可以看出胞外蛋白酶的最適pH為9，pH低于5或高于10酶活性受到很大影響，處于一個較低水平。

圖7 pH對ECPase活性的影響Fig.7 Effect of pH on activity of ECPase

2.8 溫度對胞外蛋白酶活性影響

純化的ECPase在pH9條件下，55、100℃分別處理5、10、20、35、50 min 后發現 ECPase在 55 ℃ 下作用50 min，其活性并沒有大幅度的下降，但在100℃下處理30 min后其活性則基本喪失。將ECPase分別在 0、20、30、37、50、56、60、70、80、90 和 100 ℃下處理1 h，再測定其酶活性，繪制酶活性變化曲線(圖8)，結果表明酶活性于50～60℃最佳，溫度過低過高酶活性都將降低。

圖8 溫度對ECPase活性的影響Fig.8 Effect of temperature on activity of ECPase

2.9 金屬離子對胞外蛋白酶活性影響

將濃度為 1 mmol/L 的 CaCl2、ZnSO4、MnCl2、BaCl2、FeCl3、CuSO4及 MgCl2等金屬鹽溶液分別和純化的ECPase作用，32℃下處理0.5 h，再測定其酶活性。結果如圖10所示，Mg2+、Cu2+對胞外蛋白酶活力影響不大，其他離子對胞外蛋白酶均有不同程度的抑制作用。

圖9 金屬離子對ECPase活性的影響Fig.9 Effect of metal anions on activity of ECPase

2.10 抑制劑對胞外蛋白酶活性影響

純酶液與選擇性抑制劑以1∶1(V/V)混合，于26℃溫浴1 h后，測680 nm處OD值，計算蛋白酶活力。實驗結果如圖10所示，PMSF對胞外蛋白酶活力影響不大，而DETA則能大大降低蛋白酶活力。

3 討論

本實驗從傳統泡菜中分離得到16株乳桿菌，通過脫脂乳平板試驗篩選出12株產蛋白酶的菌株，結合福林酚法測定12株乳桿菌分泌的蛋白酶活力。其中以菌株 L4產蛋白酶活力最高，粗酶活力可達25.12 U/mL。利用分子生物學方法對該菌株進行PCR鑒定，并對其產酶條件進行了研究。結果顯示，該菌株的堿基序列與多株植物乳桿菌(JX025073.1、JQ236622.1、JN680707.1、AB362759.1、EU559598.1等)相應的16S rDNA序列99%相似，可以鑒定其為植物乳桿菌。由純化的胞外蛋白酶的圖譜可以得出該胞外蛋白酶的分子量為40 kDa。胞外酶活力最適pH為9，在50～60℃范圍酶較穩定，該胞外蛋白酶在55℃下作用50 min，其活性并沒有大幅度的下降，但在100℃下處理30 min后其活性才基本喪失。抑制試驗發現Ca2+、Ba2+、Zn2+、EDTA能大大抑制該蛋白酶活性，而 Mg2+、Mn2+、Cu2+、PMSF 對胞外蛋白酶活力影響不大。

圖10 抑制劑對ECPase活性的影響Fig.10 Effect of Inhibitor on activity of ECPase

植物乳桿菌屬于乳桿菌科中的乳桿菌屬，兼性異型乳酸發酵。據資料研究表明植物乳桿菌在乳中發酵存在一些生長限制因子，幾乎不能在乳中單獨生長繁殖、發酵產酸。其中的原因可能是植物乳桿菌不編碼細胞壁蛋白水解酶，植物乳桿菌存在OPP和DTPT轉運系統和一些胞內肽酶(內肽酶，氨肽酶，脯氨酸特異性酶，二肽酶，三肽酶)，由于植物乳桿菌缺乏細胞壁表面的蛋白水解酶，不能很好利用酪蛋白，因此在牛乳發酵中周期較長［15］。目前，植物乳桿菌在發酵乳制品中的應用僅限于將植物乳桿菌作為輔助菌株，與干酪發酵劑同時加入促進干酪風味形成或增加產品益生功能。因此，利用本實驗得到的高產蛋白酶的植物乳桿菌制成發酵劑發酵蛋白質食品，可以使蛋白質等大分子物質被降解成氨基酸等有利于人體吸收的小分子物質，提高食物營養資源的利用率。因此，本實驗的研究可以為充分發掘傳統發酵食品中豐富的微生物資源，制備優質發酵劑打下基礎，具有良好的應用價值。

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