重組畢赤酵母中腺苷甲硫氨酸的純化*

傅夢月，張建國，張繼寧

1(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海，200093)2(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境保護研究所，上海，201403)

腺苷甲硫氨酸(S-Adenosyl-L-methionine，SAM)在生物體中發(fā)揮著多種重要的生物功能［1］。而且，SAM處于多種代謝物的代謝途徑的中心位置。實際上SAM分子中每一部分都會轉(zhuǎn)化為有用的中間代謝物。在臨床上，SAM可以用來治療抑郁癥、骨關(guān)節(jié)炎、纖維肌痛、老年癡呆癥等［2］。1999年美國食品和藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)將其作為營養(yǎng)強化劑添加到食品中。在歐洲，SAM在70年代就在市場上銷售了。近年來，有關(guān)SAM的生產(chǎn)一直是科研和工業(yè)界人員關(guān)注的熱點。SAM的生產(chǎn)可以來自化學(xué)合成法，以ATP和L-甲硫氨酸為底物的酶促反應(yīng)，以帶有高活力的腺苷甲硫氨酸合成酶的微生物發(fā)酵方法。其中微生物發(fā)酵方法由于產(chǎn)量高，成本低，產(chǎn)物中S，SSAM比例高而獲得廣泛認可。很多微生物都被報道用于積累 SAM，例如擬球酵母屬［3］，面包酵母［4］，釀酒酵母［5］，產(chǎn)元假絲酵母［6］，乳酸克魯維酵母［7－8］，大腸桿菌等［9］。經(jīng)過篩選［10］和突變后［11－12］的微生物菌種發(fā)酵所得最高產(chǎn)量為10.08 g/L［4］。用基因工程法重組的釀酒酵母［13］和畢赤酵母［14］也是生產(chǎn)SAM的重要微生物資源。畢赤酵母由于SAM合成酶表達的嚴(yán)格控制機制［14］，發(fā)酵工藝易于操作，細胞高密度等優(yōu)點而被廣泛研究［15］。例如，ZHANG從細胞濃度和甲醇的濃度方面入手，以細胞維持能為指標(biāo)優(yōu)化SAM的產(chǎn)量［16］。SAM的產(chǎn)量還受到培養(yǎng)液中銨離子濃度［17］，氧載體和輔助碳源［18］的明顯影響。

有關(guān)SAM的分離純化工藝的報道并不多。這可能與SAM在中性和堿性條件下不穩(wěn)定有關(guān)。SAM純化工藝的部分階段的研究，例如細胞破碎、SAM的穩(wěn)定性都有所報道［19－20］。LIU運用有機酸沉淀的方式獲得SAM硫酸鹽的回收率為60%，SAM硫酸和對甲苯磺酸雙鹽的回收率為60%［21］。由于含有微量雜質(zhì)SAM非常容易吸潮，其純度是純化工藝的重要指標(biāo)。本研究報道了從重組畢赤酵母中純化SAM的具有較高純度和回收率的完整工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 畢赤酵母和樹脂

重組具有釀酒酵母SAM合成酶基因(Sam2)的畢赤酵母，以醇氧化酶I啟動子表達SAM合成酶。表達質(zhì)粒pPIC9K的α-信號肽在應(yīng)用前被切除［18］。大孔樹脂購自上海華震科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)酵工藝

畢赤酵母在YPD培養(yǎng)基(10 g/L酵母粉，20 g/L蛋白胨，20 g/L葡萄糖，固體培養(yǎng)基時需要添加20 g/L瓊脂粉)生長后(30℃直到OD600為2～10)，接種到發(fā)酵罐(BLBIO-2GL，上海百倫生物科技有限公司)中培養(yǎng)(4%接種量)。發(fā)酵罐中含有1.5 L基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(basic salt medium，BSM)。BSM培養(yǎng)基的組分為 40 g/L 甘油，18.6 g/L K2SO4，14.9 g/L MgSO4·7H2O，4.13 g/L KOH，26.7 mL/L H3PO4，0.93 g/L CaSO4，4.35 mL/L微量元素溶液 (6 g/L CuSO4·5H2O，0.09 g/L KI，3g/L MnSO4·H2O，0.02g/L H3BO3，0.24 g/L MoNa2O4·2H2O，0.5 g/L CoCl2，20 g/L ZnCl2，65 g/L FeSO4·H2O，0.2 g/L 生物素，5.0 mL/L H2SO4)。微量元素在應(yīng)用前經(jīng)過直徑為0.22 μm的膜過濾除菌。在發(fā)酵過程中，畢赤酵母的培養(yǎng)條件為pH 5.0，500 r/min，30℃。畢赤酵母的發(fā)酵過程如下:畢赤酵母首先在BSM培養(yǎng)基中生長16～20 h。接著流加50%甘油(含有12 ml/L微量元素溶液)直到細胞濃度達到110 g DCW/L(干細胞重，約30 h)。然后等待0.5～2 h使畢赤酵母消耗完培養(yǎng)液中的殘余甘油。最后流加甲醇(含有12 mL/L微量元素溶液)誘導(dǎo)畢赤酵母高效表達SAM合成酶［16］。在流加甲醇誘導(dǎo)2 h后加入10 g/L甲硫氨酸使畢赤酵母細胞積累SAM。

1.2.2 細胞破碎

離心(6 000 r/min，3 min)收集細胞后，以去離子水洗滌細胞2次。本研究中采用3種方法破碎細胞:1.0 kg濕細胞與4 L 1 mol/L高氯酸在4℃下混合2 h;1.0 kg濕細胞與4 L 1 mol/L乙酸乙酯和1 mol/L硫酸(1 mol/L)在4℃下混合2 h;1.0 kg濕細胞與4 L 1 mol/L硫酸在4℃下混合2 h。然后離心收集上清(6 000 r/min，10 min)。發(fā)酵液和等體積20%高氯酸混勻后冷卻至4℃，放置8 h以上，離心(12 000 r/min)3 min，經(jīng)0.22 μm膜過濾，上清液中SAM含量作為細胞中絕對SAM含量。

1.2.3 樹脂的靜態(tài)篩選

首先，10 g大孔樹脂(表1)與50 mL SAM溶液在100 r/min，0℃混合吸附SAM。利用過濾的方式回收樹脂。樹脂與50 mL 1mol/L硫酸在100 r/min，0℃下解析SAM。操作期間提取SAM溶液，測定吸附和解析的效果。

表1 本研究中采用的4種樹脂Table 1 Four types of resin used in this study

1.2.4 靜態(tài)條件下SAM濃度與pH對吸附的影響

10 g D151分別與50 mL質(zhì)量濃度為5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 g/L 的 SAM 溶液在100 r/min，0 ℃混合2 h。利用氨水調(diào)節(jié)pH值分別為1.5、2.5、3.5、4.5、5.5。SAM 吸附率計算:

式中，C0:初始 SAM質(zhì)量濃度，g/L;C:吸附后SAM質(zhì)量濃度，g/L。

1.2.5 靜態(tài)條件下硫酸溶液濃度對SAM解吸的影響

吸附SAM后的10 g D151樹脂經(jīng)過分離后在pH4.5，100 r/min下分別與 50 mL 濃度為 5、10、20、50、100、200、500、1 000 mmol/L 的硫酸溶液混合1 h。

1.2.6 SAM溶液的流速對SAM吸附的影響以及硫酸對SAM解吸的影響

SAM 溶液 (7.71 g/L，pH 4.5)分別以 0.1、0.2、0.5、1.0 mL/min的流速流過D151柱 (8 cm×2 cm)。然后以2倍柱體積去離子水洗滌。用0.1 mol/L的硫酸分別以 0.1、0.2、0.5、1.0 mL/min洗脫。每 5 min收集洗脫液進行分析。

1.2.7 SAM分析

采用高效液相色譜法(Waters 1525，2487，Milford，United States)。SAM樣品經(jīng)過直徑為0.22 μm的膜過濾后進行分析。液相色譜柱為Hypersail SCX column(4.6mm ×250 mm，5 μm)。流動相為 0.5 mol/L甲酸銨溶液(pH4.0)。

2 結(jié)果和分析

2.1 不同細胞破碎方法對SAM釋放的影響

本研究參考了文獻中機械沖壓、超聲等方法后采用化學(xué)溶劑法破碎細胞。這是由于化學(xué)法破碎細胞成本低，容易放大操作規(guī)模。在1 mol/L高氯酸、1 mol/L乙酸乙酯和1 mol/L硫酸、1 mol/L硫酸破碎溶液中 SAM的釋放率分別為 96.22%、94.02%、75.00%(表2)。相比硫酸，高氯酸屬于強氧化劑，考慮到化學(xué)溶劑對環(huán)境的危害，所以盡量減少高氯酸的使用。在1 mol/L硫酸中SAM的釋放量較低(75.00%)，所以1 mol/L乙酸乙酯和1 mol/L硫酸的混合溶液作為破碎細胞的溶液。在乙酸乙酯和硫酸的混合溶液破碎細胞過程過程中，乙酸乙酯可以溶解細胞壁的脂層導(dǎo)致細胞的破碎，硫酸可以將細胞膜水解完全，最后導(dǎo)致較高的破碎率。而且SAM在酸性環(huán)境下比較穩(wěn)定。

表2 不同化學(xué)試劑破碎細胞的SAM釋放率Table 2 SAM released ratios by different chemicals

2.2 樹脂的靜態(tài)篩選

圖1是50 mL 7.71 g/L SAM溶液分別與4種樹脂混合時溶液中SAM濃度的變化。4種不同樹脂都可以很好地吸附SAM，最后溶液中SAM濃度都降低為0.5 g/L。但是SAM濃度的降低速率從快到慢依次為JK110、D151、HD-1、DK110。強酸性樹脂(JK110)比弱酸性樹脂(DK110)對SAM的吸附速度快。DK110需要60 min達到SAM濃度的吸附平衡。而其他3種樹脂需要30～35 min達到吸附平衡。D151與JK110具有相似的吸附曲線，說明具有相似的吸附能力。

圖1 靜態(tài)條件下不同樹脂對SAM的吸附曲線Fig.1 SAM absorption by different resins at different times

利用1 mol/L硫酸分別洗脫4種吸附SAM后的樹脂的結(jié)果見圖2。JK110釋放SAM的速度最慢。HD-1釋放SAM的速率比較穩(wěn)定，比DK110和D151慢。DK110和D151釋放SAM的速率相近。結(jié)合圖1，D151對SAM的交換容量最大，所以本研究中選擇D151作為分析SAM的樹脂材料。

圖2 靜態(tài)條件下硫酸溶液洗脫不同樹脂上SAM的曲線Fig.2 SAM deabsorption from different resins in sulfuric acid solution

2.3 SAM質(zhì)量濃度和pH對D151吸附SAM的影響

SAM溶液的質(zhì)量濃度由5.00 g/L提高到15.00 g/L，D151對SAM的吸附量也逐漸增加 (表3)。可是，SAM的吸附率由95.00%降低到55.73%。考慮到初始SAM的濃度和吸附率，本研究中采用SAM溶液的質(zhì)量濃度為7.50 g/L。

表3 SAM濃度對D151吸附SAM的影響Table 3 Effects of SAM concentrations on SAM absorption to D151

由于SAM分子上具有豐富的離子基團(圖3)，選用離子交換法是分離SAM的主要手段。SAM分子中腺苷上氨基的等電點為pH3.4，核糖上羥基的等電點為pH12.5，L-甲硫氨酸上氨基和羧基的等電點分別為pH7.8和pH1.8。可見，在任何pH值下SAM分子都有基團處于離子化的狀態(tài)。由于SAM在堿性環(huán)境中不穩(wěn)定，所以SAM的純化過程要保持酸性環(huán)境。由于D151是弱酸性陽離子交換樹脂(表1)，SAM的吸附量和吸附率在pH由2.5升高為6.5時也升高(表 4)。SAM吸附率由14.94% 提高到96.23%。SAM吸附率在pH4.5時為92.95%。pH繼續(xù)升高時SAM吸附率升高不明顯。D151在pH4.5吸附SAM量為36.95 mg SAM/g樹脂。

圖3 SAM的分子結(jié)構(gòu)Fig.3 Molecular structure of SAM

表4 pH對D151吸附SAM的影響Table 4 Effect of pH on SAM absorption to D151

2.4 硫酸濃度對SAM洗脫的影響

硫酸溶液作為洗脫液在濃度升高時，SAM的洗脫率逐漸升高(圖4)。圖4中SAM的洗脫率可以分為3個階段:硫酸濃度在20 mmol/L以下，SAM的洗脫率升高緩慢;硫酸濃度在20 mmol/L和100 mmol/L之間SAM的洗脫率快速升高;硫酸濃度高于100 mmol/L后SAM的洗脫率升高平緩。

圖4 不同濃度硫酸對洗脫SAM的影響Fig.4 SAM released ratio from D151 by different sulfuric acid concentrations

2.5 SAM溶液的流速對SAM吸附的影響

SAM溶液的流速對D151吸附SAM的結(jié)果見圖5。本研究以吸附90%作為基本要求。在SAM溶液流速分別為 0.1、0.2、0.5、1.0 mL/min 時 D151 吸附90%SAM 所需要的時間分別為 1150、360、200、70 min。本研究采用0.2 mL/min流速的SAM溶液，吸附率為92.00%。

圖5 SAM溶液的流速對D151吸附SAM的影響Fig.5 Effect of SAM solution flow rate on SAM absorption to D151

2.6 硫酸溶液的洗滌流速對洗脫SAM的影響

表5是硫酸溶液洗脫的流速對SAM洗脫的影響。SAM的洗脫率隨著硫酸溶液的流速逐漸增加而先升高而后降低。在硫酸溶液的流速為0.2 mL/min時SAM的洗脫率為最高(92.52%)。SAM的溶液經(jīng)過高效液相色譜測定后純度為92%(圖6)。

3 結(jié)論

本研究報道了一個完整的SAM的純化工藝的優(yōu)化過程。在這個純化工藝中，首先采用化學(xué)試劑法破碎細胞得到94.02%的SAM釋放率。然后經(jīng)過離子交換樹脂純化SAM(92.00%吸附率，92.52%洗脫率)的純度為92%。本工藝中SAM的最終回收率達到80.03%。

圖6 分離后SAM溶液的高效液相色譜分析圖Fig.6 SAM analysis by HPLC

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