分光光度計(jì)比濁法測(cè)定抗菌物質(zhì)效價(jià)*

王凱旋，衛(wèi)蘭蘭，洪婷，付瑞燕

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽合肥，230036)

抗菌物質(zhì)是指具有殺菌或抑菌活性的物質(zhì)，包括細(xì)菌素、類細(xì)菌素和抗生素等生物活性物質(zhì)。在過(guò)去的60多年里，多種能準(zhǔn)確測(cè)定抗菌物質(zhì)活性的方法先后被提出，包括ATP生物發(fā)光測(cè)定法(ATP Bioluminometry)、綠色熒光蛋白測(cè)定法(GFP bioassay)、MTT［3-(4，5-dimethyl thiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide］比色法、免疫學(xué)方法等［1－4］，然而使用這些方法需要特殊的試劑或儀器設(shè)備，因此沒(méi)有得到廣泛應(yīng)用。長(zhǎng)期以來(lái)，瓊脂擴(kuò)散法(agar diffusion assay)因無(wú)需特殊材料，檢測(cè)成本低［5－6］而成為測(cè)定抗菌物質(zhì)活性最常用的方法，但是該法耗時(shí)耗力、對(duì)操作人員經(jīng)驗(yàn)要求高、人為影響因素多，實(shí)驗(yàn)者經(jīng)常得不到理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果［7］。1952年，Berridge和Barrett首次應(yīng)用微孔比濁法來(lái)測(cè)定抗生素效價(jià)［8］，經(jīng)過(guò)幾十年的不斷改進(jìn)，該法已以成為可以定量測(cè)定抗菌物質(zhì)的一種方法［9－10］，但是，需要使用酶標(biāo)儀這一“短板”限制了其廣泛應(yīng)用，如能建立起分光光度計(jì)比濁法無(wú)疑將極大提高其應(yīng)用普遍性。為此本研究對(duì)于影響分光光度計(jì)比濁法準(zhǔn)確定量抗菌物質(zhì)效價(jià)的關(guān)鍵因素進(jìn)行了研究，建立了測(cè)定細(xì)菌素nisin、類細(xì)菌素NFL［11］和抗生素硫酸慶大霉素等抗菌物質(zhì)效價(jià)的分光光度計(jì)比濁法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

金黃桿菌(Chryseobacterium)NHW菌株、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NFL菌株和乳酸乳球菌(L.lactis)8148菌株，為安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品微生物實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

STAA培養(yǎng)基:蛋白胨20 g，酵母抽提物2 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 1 g，甘油 15 g，瓊脂13 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0±0.2，121℃下15 min滅菌后冷卻至40～50℃左右，加入過(guò)濾除菌的鏈霉素500 mg，環(huán)己六亞胺50 mg和乙酸鹽50 mg混勻，用于培養(yǎng)金黃桿菌NHW菌株。

MRS培養(yǎng)基:牛肉浸膏8.0 g，Tween-80 1.0 mL，葡萄糖20.0 g，胰蛋白胨10.0 g，酵母抽提物4.0 g，K2HPO42.0 g，檸檬酸三銨 2.0 g，醋酸鈉 5.0 g，Mn-SO4·H2O 0.05 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 6.0±0.2。用于培養(yǎng)乳酸乳球菌NFL菌株。

GM17培養(yǎng)基:補(bǔ)充了15 g/L葡萄糖的M17培養(yǎng)基(購(gòu)自青島海博)，用于培養(yǎng)乳酸乳球菌8148菌株。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 抗菌物質(zhì)抗菌類型的確定

乳酸乳球菌NFL發(fā)酵上清液的制備:將活化后的乳酸乳球菌NFL菌株以5%接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)12 h，離心(10 000 r/min，15 min)取上清液，將上清液過(guò)濾除菌，取濾液備用。

硫酸慶大霉素、氯霉素和類細(xì)菌素NFL抗菌類型的確定:將活化后的指示菌金黃桿菌NHW菌株以5%接種量接種于STAA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，離心(10 000 r/min，5 min)取菌體，用生理鹽水洗滌1次，將菌體重懸于生理鹽水中，分別添加終質(zhì)量濃度為16.67 μg/mL的氯霉素乙醇溶液、888.89 U/mL的硫酸慶大霉素水溶液、66.67 μL/mL的NFL菌上清液，30℃下振蕩 (150 r/min)培養(yǎng)6 h，分別在培養(yǎng)的0時(shí)刻和6 h取200 μL發(fā)酵液涂布于STAA平板表面，30℃下培養(yǎng)測(cè)定菌落總數(shù)。

nisin抗菌類型的確定:將活化后的指示菌乳酸乳球菌8148菌株以5%接種量接種于GM17液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，離心(10 000 r/min，5 min)取菌體，用生理鹽水洗滌1次，將菌體重懸于生理鹽水中，添加終濃度為1.5 U/mL的nisin鹽酸溶液(0.02 mol/L)。30℃下靜置培養(yǎng)6 h，分別在培養(yǎng)的0 h和6 h取200 μL發(fā)酵液涂布于GM17平板表面，30℃下培養(yǎng)測(cè)定菌落總數(shù)。

1.2.2 不同抗菌物質(zhì)抑菌率曲線的測(cè)定

將活化后的指示菌以2%的接種量接種于相應(yīng)的培養(yǎng)基中，實(shí)驗(yàn)組分別加入終質(zhì)量濃度為16.67 μg/mL的氯霉素乙醇溶液(對(duì)照為無(wú)水乙醇)、888.89 U/mL的硫酸慶大霉素水溶液(對(duì)照為無(wú)菌水)、66.67 μL/mL的NFL菌株發(fā)酵上清液(對(duì)照為MRS培養(yǎng)基)和0.5 U/mL的nisin鹽酸溶液(對(duì)照為0.02 mol/L HCl溶液)，培養(yǎng)過(guò)程中每隔2 h取樣，立即轉(zhuǎn)入冰水浴中以終止微生物生長(zhǎng)，于600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值(上海菁華，752紫外可見(jiàn)分光光度計(jì))，連續(xù)測(cè)定至14 h。對(duì)照組加入量與實(shí)驗(yàn)組體積相同，其余方法同實(shí)驗(yàn)組。

抑菌率/%=(OD對(duì)照－OD實(shí)驗(yàn))/OD對(duì)照×100

1.2.3 抗菌物質(zhì)效價(jià)分光光度計(jì)比濁法的建立

1.2.3.1 指示菌接種量對(duì)最佳取樣時(shí)間點(diǎn)的影響

乳酸乳球菌8148接種量對(duì)nisin效價(jià)測(cè)定取樣時(shí)間點(diǎn)的影響:將活化后的乳酸乳球菌8148菌株分別以2%、5%、8%的接種量接入GM17培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組中加入終濃度為0.5 U/mL的nisin鹽酸溶液，分別在30℃下靜置培養(yǎng)1、2、3 h，取樣，測(cè)定抑菌率和發(fā)酵液濁度增量，濁度增量OD600=OD600實(shí)驗(yàn)－OD600起始。

金黃桿菌NHW接種量對(duì)類細(xì)菌素NFL效價(jià)測(cè)定取樣時(shí)間點(diǎn)的影響:將活化后的金黃桿菌NHW分別以1%、2%、3%的接種量接入STAA培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組中加入終濃度為66.67 μL/mL的NFL菌株發(fā)酵上清液，分別在30℃下振蕩培養(yǎng)3、4、5 h取樣，測(cè)定抑菌率和發(fā)酵液濁度增量OD600。

1.2.3.2 測(cè)定抗菌物質(zhì)效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

nisin效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:將活化后的乳酸乳球菌8148菌株以5%的接種量接入GM17培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組中加入終濃度為 0.2、0.5、0.8、1.1、1.4 U/mL的nisin鹽酸溶液，在30℃下靜置培養(yǎng)2 h，取樣測(cè)定抑菌率。另一實(shí)驗(yàn)組中加入終濃度為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 U/mL的nisin鹽酸溶液，在30℃下靜置培養(yǎng)5 h，取樣測(cè)定抑菌率。

2 h取樣的nisin效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn):將活化后的乳酸乳球菌8148菌株以5%的接種量接入GM17培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組中加入終濃度為0.4、1.0 U/mL的nisin鹽酸溶液，在30℃下靜置培養(yǎng)2 h，取樣測(cè)定抑菌率。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算這兩個(gè)樣品的測(cè)定誤差率(RSD)。

類細(xì)菌素NFL效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:將活化后的金黃桿菌NHW以2%的接種量接入STAA培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組中加入終濃度為 36.67、43.33、50.00、56.67、63.33 μL/mL 的 NFL 菌株發(fā)酵上清液，分別在30℃下振蕩培養(yǎng)4 h，取樣測(cè)定抑菌率。測(cè)定終濃度為40、60 μL/mL的NFL菌株發(fā)酵上清液的抑菌率，用所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算這兩個(gè)樣品的測(cè)定誤差率(RSD)。

硫酸慶大霉素效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:將活化后的金黃桿菌NHW菌株以2%的接種量接入STAA培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組中加入終濃度為444.44、533.33、622.22、711.10、799.99、888.88 U/mL 的硫酸慶大霉素水溶液，分別在30℃下振蕩培養(yǎng)4 h，取樣測(cè)定抑菌率。測(cè)定終濃度為577.77、755.55 U/mL的硫酸慶大霉素水溶液的抑菌率，用所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算這兩個(gè)樣品的測(cè)定誤差率(RSD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抗菌物質(zhì)的抑菌率曲線

從圖1可以看出，隨著指示菌在硫酸慶大霉素水溶液中處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞逐步被殺死，失去生長(zhǎng)能力。而指示菌在nisin、氯霉素和NFL菌株發(fā)酵上清液中處理6 h，活菌數(shù)下降幅度均很小，nisin和氯霉素是已知的抑菌劑，表明NFL菌株發(fā)酵上清液具抑菌活性而非殺菌活性。

在指示菌培養(yǎng)基中分別添加以上各種抗菌劑后，測(cè)定其生長(zhǎng)曲線，計(jì)算得到抑菌率曲線。從圖2可見(jiàn)，抑菌類抗菌劑nisin、氯霉素和NFL菌株發(fā)酵上清液的抑菌率曲線趨勢(shì)基本一致，都是先上升后下降，有一個(gè)明顯的峰值，也就意味著此時(shí)測(cè)定抑菌率，對(duì)于抗菌劑濃度的變化最為敏感。因此，將此時(shí)間點(diǎn)定為抑菌類抗菌劑最佳取樣時(shí)間點(diǎn)。而殺菌類抗菌劑硫酸慶大霉素的抑菌率曲線是快速上升至一個(gè)高點(diǎn)，穩(wěn)定一段時(shí)間后，再緩慢上升。

圖1 抗菌物質(zhì)抗菌類型的確定Fig.1 Determination of antimicrobial types of antimicrobial substances

圖2 不同抗菌物質(zhì)的抑菌率曲線Fig.2 The inhibitory rate curves of different antimicrobial substances

2 抗菌物質(zhì)效價(jià)分光光度計(jì)比濁法的建立

2.1 接種量對(duì)最佳取樣時(shí)間點(diǎn)的影響

抑菌率計(jì)算的依據(jù)是生物量，而接種量的大小會(huì)直接影響微生物細(xì)胞生物量的高低，因此研究了指示菌接種量對(duì)最佳取樣時(shí)間點(diǎn)的影響。從圖3可以看出，中等(5%)和較高(8%)接種量下測(cè)定nisin濃度的最佳取樣時(shí)間點(diǎn)均為2 h。低接種量(2%)下，指示菌培養(yǎng)3 h的抑菌率高于2 h的，導(dǎo)致測(cè)定nisin濃度的最佳取樣時(shí)間點(diǎn)延后。最佳取樣時(shí)間點(diǎn)的確定不僅取決于最高抑菌率，還要兼顧指示菌生長(zhǎng)增量和培養(yǎng)時(shí)間，如圖3所示，低接種量(2%)下指示菌培養(yǎng)3h的對(duì)照組(未添加 nisin)發(fā)酵液濁度增量(OD600)很低，表明此時(shí)體系中的活菌量較低，不能很好地表征nisin的抑菌效力，且培養(yǎng)時(shí)間偏長(zhǎng)。因此，以乳酸乳球菌8148為指示菌來(lái)測(cè)定nisin濃度，最佳指示菌接種量為5%，最佳取樣時(shí)間點(diǎn)為2 h。

圖3 指示菌乳酸乳球菌8148接種量對(duì)測(cè)定nisin效價(jià)的取樣時(shí)間點(diǎn)的影響(虛線為濁度增量，實(shí)線為抑菌率)Fig.3 Influence of inoculum of indicator L.lactis 8148 on the sampling time point of nisin potency determination

由圖4可以看出，以金黃桿菌NHW為指示菌來(lái)測(cè)定類細(xì)菌素NFL的效價(jià)，同樣也表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)，最佳指示菌接種量為2%，最佳取樣時(shí)間點(diǎn)為4 h。

圖4 指示菌金黃桿菌NHW接種量對(duì)測(cè)定類細(xì)菌素NFL效價(jià)的取樣時(shí)間點(diǎn)的影響(虛線為濁度增量，實(shí)線為抑菌率)Fig.4 Influence of inoculum of indicator Chryseobacterium NHW on the sampling time point of bacteriocin-like substance NFL potency determination

2.2 分光光度計(jì)比濁法測(cè)定抗菌物質(zhì)效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

2.2.1 測(cè)定nisin效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以5%接種量接種指示菌乳酸乳球菌8148，在GM17培養(yǎng)基中添加不同終濃度的nisin，培養(yǎng)2 h，測(cè)定抑菌率，以抑菌率對(duì)nisin濃度值進(jìn)行線性回歸。由圖5可知，在nisin終濃度為0.2～1.4 U/mL，抑菌率為25%～98%的范圍內(nèi)，nisin濃度與抑菌率之間呈良好的線性關(guān)系(R2=0.9921)，驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)(表1)表明，該方法的準(zhǔn)確度較高(RSD＜5%)。在非最佳取樣時(shí)間點(diǎn)測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的R2值低于0.99，表明此時(shí)取樣測(cè)定所得數(shù)據(jù)的線性相關(guān)度偏低;此外，此時(shí)回歸方程的斜率也低于最佳取樣時(shí)間點(diǎn)的，表明在非最佳取樣時(shí)間點(diǎn)下抑菌率對(duì)nisin濃度變化的敏感度偏低。

圖5 不同取樣時(shí)間點(diǎn)下nisin標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定Fig.5 Determination of nisin standard curve under different sampling time points

表1 2 h取樣時(shí)的nisin標(biāo)準(zhǔn)曲線的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)Table 1 The verification experiment of 2 h-sampling nisin standard curve

2.2.2 測(cè)定類細(xì)菌素NFL效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

乳酸乳球菌NFL菌株發(fā)酵上清液中含有類細(xì)菌素NFL，與nisin不同，NFL菌株發(fā)酵上清液不是純品，其中還含有未被細(xì)胞利用完的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及代謝產(chǎn)物，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，本比濁法同樣適用于發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)活性的定量測(cè)定。以2%接種量接種指示菌金黃桿菌NHW菌株，在STAA培養(yǎng)基中添加不同體積的NFL菌株發(fā)酵上清液，培養(yǎng)4 h，測(cè)定抑菌率，以抑菌率對(duì)NFL菌株發(fā)酵上清液添加量進(jìn)行線性回歸。由圖6可知，在NFL菌株發(fā)酵上清液添加量為36～64 μL/mL，抑菌率為7% ～58%的范圍內(nèi)，發(fā)酵上清液添加量與抑菌率之間的線性相關(guān)良好(R2=0.994)，驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)(表2)表明該方法的準(zhǔn)確度較高(RSD＜5%)。

圖6 乳酸乳球菌NFL菌株發(fā)酵上清液標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定Fig.6 Determination of standard curve of L.lactis NFL fermentation liquid supernatant

表2 乳酸乳球菌NFL菌株發(fā)酵液上清液標(biāo)準(zhǔn)曲線的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)Table 2 The verification experiment of supernatant of L.lactis NFL fermentation liquid standard curve

2.2.3 測(cè)定硫酸慶大霉素效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

由圖7可知，nisin測(cè)定最佳取樣時(shí)間點(diǎn)(2 h)所對(duì)應(yīng)的時(shí)刻是實(shí)驗(yàn)組(培養(yǎng)基中含0.5 U/mL的nisin)生長(zhǎng)曲線的對(duì)數(shù)前期。如前所述，硫酸慶大霉素的抑菌率曲線與nisin等抑菌劑的不同，并沒(méi)有呈現(xiàn)明顯的峰值，但在4 h時(shí)抑菌率會(huì)處于一直較高的平臺(tái)，此時(shí)對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組也基本處于對(duì)數(shù)前期(圖8)。

圖7 指示菌乳酸乳球菌8148生長(zhǎng)曲線及nisin抑菌率曲線Fig.7 Indicator L.lactis 8148 growth curves and inhibitory rate curve of nisin

圖8 指示菌金黃桿菌NHW生長(zhǎng)曲線及硫酸慶大霉素抑菌率曲線Fig.8 Indicator Chryseobacterium NHW growth curves and inhibitory rate curve of gentamicin sulfate

以2%接種量接種指示菌金黃桿菌NHW菌株，在STAA培養(yǎng)基中添加不同濃度的硫酸慶大霉素，培養(yǎng)4 h，測(cè)定抑菌率，以抑菌率對(duì)硫酸慶大霉素濃度值進(jìn)行線性回歸。由圖9可知，在硫酸慶大霉素終濃度為444～888 U/mL，抑菌率為30% ～64%的范圍內(nèi)，硫酸慶大霉素濃度與抑菌率之間的線性相關(guān)良好(R2=0.9901)，驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)(表3)表明該方法的準(zhǔn)確度較高(RSD＜5%)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，如果以6 h(即對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組對(duì)數(shù)末期)為取樣時(shí)間點(diǎn)所取得的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的R2值只有0.9673(圖9)，表明此時(shí)的硫酸慶大霉素濃度與抑菌率之間的線性關(guān)系較差。

圖9 不同取樣時(shí)間點(diǎn)下硫酸慶大霉素效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定Fig.9 Determination of gentamicin sulfate standard curve under different sampling time points

表3 硫酸慶大霉素4h取樣標(biāo)準(zhǔn)曲線的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)Table 3 The verification experiment of 4 h-sampling gentamicin sulfate standard curve

3 討論

采用比濁法測(cè)定抗菌物質(zhì)特別是抗生素效價(jià)的文獻(xiàn)不少，方法大致都是將抗菌物質(zhì)加入指示菌培養(yǎng)體系中培養(yǎng)一段時(shí)間(一般為2～5h)測(cè)定濁度，抗菌物質(zhì)濃度的對(duì)數(shù)與濁度在一定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R2＞ 0.99)［12－14］。但這些報(bào)道中均沒(méi)有說(shuō)明抗菌物質(zhì)與指示菌培養(yǎng)時(shí)間(即取樣測(cè)定濁度的時(shí)間點(diǎn))的確切依據(jù)。李秀蘭等采用分光度度計(jì)比濁法測(cè)定抗菌肽活性，抗菌肽濃度與活力單位之間線性關(guān)系良好，但是操作較為復(fù)雜，需要將對(duì)數(shù)期的指示菌菌體洗滌后重懸于緩沖液中，加入抗菌肽樣品振蕩培養(yǎng)30 min后測(cè)定濁度，將所測(cè)結(jié)果代入經(jīng)驗(yàn)公式得到活力單位［15］。同樣，作者也沒(méi)有說(shuō)明為何要培養(yǎng)30 min，這樣對(duì)于其他種類抗菌物質(zhì)效價(jià)的測(cè)定，并不具有直接的借鑒意義。

本研究所建立的比濁法是將抑菌率與抗菌物質(zhì)濃度之間直接建立線性相關(guān)，并且找到了抑菌劑和抗菌劑效價(jià)線性定量測(cè)定的關(guān)鍵因子，即取樣時(shí)間點(diǎn)。以nisin和硫酸慶大霉素的效價(jià)測(cè)定為例(圖5和圖9)，如果取樣時(shí)間點(diǎn)選擇得不好，所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線R2值就會(huì)小于0.99，達(dá)不到線性相關(guān)的要求。無(wú)論是nisin這種抑菌劑還是硫酸慶大霉素這種殺菌劑，最佳取樣時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)的都是實(shí)驗(yàn)組(即培養(yǎng)基中加入抗菌物質(zhì))生長(zhǎng)曲線的對(duì)數(shù)前期(圖7和圖8)，這種規(guī)律性可能是因?yàn)楸痉ú捎玫囊志手笜?biāo)依據(jù)的是對(duì)照組活細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)組中未被抑制或殺死的活細(xì)胞生長(zhǎng)能力的比較，當(dāng)取樣時(shí)間點(diǎn)為實(shí)驗(yàn)組的對(duì)數(shù)前期，實(shí)驗(yàn)組生物量基本可以反映當(dāng)時(shí)的活細(xì)胞數(shù);如果取樣時(shí)間點(diǎn)為實(shí)驗(yàn)組的對(duì)數(shù)末期，實(shí)驗(yàn)組生物量會(huì)包含部分死細(xì)胞，就會(huì)偏離效價(jià)與抑菌率之間的線性相關(guān)了。

除此之外，接種量的大小對(duì)抑菌率的高低有顯著的影響(圖3和圖4)，雖然低接種量下最高抑菌率值較高，但最佳取樣時(shí)間點(diǎn)會(huì)延后，且指示菌生長(zhǎng)速度偏低，并不能很好地表現(xiàn)出抑菌物質(zhì)的作用;高接種量從檢測(cè)時(shí)間和最高抑菌率方面均較差，因此，接種量的優(yōu)化對(duì)于提高本方法的應(yīng)用效果十分必要。

本研究所建立的分光光度計(jì)比濁法不僅可用來(lái)準(zhǔn)確測(cè)定nisin、類細(xì)菌素NFL和慶大霉素的效價(jià)，而且具有設(shè)備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。有理由相信，本方法也可以適用于其他抗菌物質(zhì)效價(jià)的測(cè)定。首先，測(cè)定抗菌物質(zhì)抑菌率曲線，以此為依據(jù)，抑菌劑以最高抑菌率對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)為取樣時(shí)間點(diǎn)，殺菌劑可以結(jié)合實(shí)驗(yàn)組生長(zhǎng)曲線和抑菌率曲線，綜合考慮實(shí)驗(yàn)組對(duì)數(shù)前期和抑菌率峰值選擇出合適的取樣時(shí)間點(diǎn);隨后，測(cè)定指示菌不同接種量下的抑菌率，確定合適的指示菌接種量;最后，建立抑菌率與抗菌物質(zhì)效價(jià)之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

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